小反刍兽疫病毒H、F蛋白抗原表位的鉴定和免疫学特性研究

论文摘要

小反刍兽疫是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要感染山羊和绵羊等小反刍动物,其发病率和死亡率很高,已经引起广泛的重视。目前小反刍兽疫在世界范围内广泛流行,对我国的养羊业构成严重威胁。因此,在我国开展小反刍兽疫的病原学、流行病诊断技术和疫苗研究具有重要意义。本研究根据生物信息学原理,应用计算机软件对小反刍兽疫（PPR）病毒的H、F蛋白的理化性质、二级结构的特性以及蛋白抗原性进行综合分析,预测出了10段可能抗原表位并人工合成,iELISA检测表明这10个肽段均可与PPRV阳性血清发生较强反应。然后将这些合成多肽分别与BSA偶联后混合免疫兔子,第三次免疫后收集血清,iELISA法检测其针对各自肽段和PPRV Nigeria 75∕1毒株的抗体滴度,同时检测血清对PPRV Nigeria 75∕1毒株的中和作用。结果显示,10条多肽均能被相应的抗体识别,具有良好的反应性;免疫家兔检测表明这些偶联多肽能诱导家兔产生PPRV Nigeria 75∕1毒株的特异性IgG抗体,且免疫家兔血清在体外具有中和PPRV Nigeria 75∕1病毒株的作用。将通过计算机软件预测和试验筛选确定的H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联,再加上一个外源通用T细胞表位,表位之间用甘氨酸间隔,人工合成一条多抗原表位编码基因序列,将其插入原核表达载体pET30a（+）,转化BL21（DE3）诱导表达,结果获得分子量为19kD的表达蛋白,该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应,表明人工合成的PPRV多抗原表位编码基因可以在原核表达系统中表达,表达产物具有反应原性。纯化抗原表位编码的重组蛋白并免疫小鼠,间接ELISA检测检测结果表明该重组蛋白可诱导小鼠产生针对PPRV Nigeria 75∕1毒株的特异性抗体。上述研究结果为开发PPRV抗原表位疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 小反刍兽疫的研究进展
• 1.1.1 概况
• 1.1.2 小反刍兽疫病毒学研究
• 1.1.3 小反刍兽疫流行病学研究
• 1.1.4 小反刍兽疫诊断方法研究
• 1.1.5 PPR 的控制和预防
• 1.2 表位疫苗研究进展
• 1.2.1 细胞抗原表位研究
• 1.2.2 表位疫苗的分子设计
• 1.2.3 多表位疫苗的应用
• 1.2.4 展望
• 第二章 小反刍兽疫病毒H、F 蛋白抗原表位的预测、多肽合成及免疫学特性研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要耗材及仪器
• 2.1.4 主要溶液及配制配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 PPRV-F 蛋白B 细胞抗原表位预测
• 2.2.2 PPRV-H 蛋白B 细胞抗原表位预测
• 2.2.3 抗原表位肽段的合成
• 2.2.4 间接ELISA 检测合成表位肽段的抗原性
• 2.2.5 多肽与BSA 偶联
• 2.2.6 多肽免疫动物
• 2.2.7 ELISA 检测免疫兔血清针对各个多肽的抗体
• 2.2.8 ELISA 检测针对 Nigeria75?1 毒株的抗体滴度
• 2.2.9 病毒中和实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 抗原表位的预测及多肽合成
• 2.3.2 合成多肽的抗原性
• 2.3.3 多肽的偶联
• 2.3.4 ELISA 检测针对各个多肽的特异性抗体
• 2.3.5 ELISA 检测针对75∕1 毒抗体滴度
• 2.3.6 病毒中和实验
• 2.4 讨论
• 第三章 小反刍兽疫病毒多抗原表位基因表达及
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌种和载体
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要溶液及配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 小反刍兽疫标准阳性血清的制备
• 3.2.3 抗原表位重组原核表达载体的构建
• 3.2.4 重组蛋白的诱导表达
• 3.2.5 表达产物的SDS－PAGE 电泳
• 3.2.6 重组蛋白表达条件的优化
• 3.2.7 重组蛋白的可溶性分析
• 3.2.8 包涵体形式重组蛋白的纯化
• 3.2.9 表达产物的Western-blotting 检测
• 3.2.10 间接ELISA 检测重组抗原表位蛋白的反应性
• 3.3 结果
• 3.3.1 小反刍兽疫标准阳性血清的制备
• 3.3.2 抗原表位基因的合成
• 3.3.3 重组抗原表位表达载体的构建
• 3.3.4 重组抗原表位基因的原核表达
• 3.3.5 重组蛋白表达条件的优化
• 3.3.6 重组蛋白的可溶性分析
• 3.3.7 表达蛋白的纯化
• 3.3.8 重组蛋白的Western-Blot 分析
• 3.3.9 ELISA 检测重组蛋白与阳性血清的反应性
• 3.4 讨论
• 第四章 抗原表位重组蛋白对小鼠的免疫效应研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 重组蛋白及实验动物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 溶液
• 4.2 动物免疫试验
• 4.2.1 试验动物及其分组
• 4.2.2 免疫小鼠血清与PPRV Nigeria 75∕1 的反应性检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 ELISA 反应结果
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介