哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆免疫保护作用

论文摘要

哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性的海洋细菌,广泛分布于海洋环境及海洋生物,能引起海水鱼类及其它养殖动物发病,是世界上许多国家和地区养殖对虾和鱼类的致病菌,也是我国海产经济鱼类弧菌病的主要病原菌之一,给海水养殖业造成了巨大的经济损失。哈维氏弧菌的胞外蛋白酶、磷酯酶、溶血素、Ⅲ型分泌系统、密度感应系统等与其致病性密切相关。目前国内对细菌病防治仍然主要靠化学药物及抗生素,由此带来的环境污染、药物残留及细菌耐药性现象日益明显。疫苗防治方法由于安全无污染,是未来疾病防治的首选措施。微生物常遇到环境中较多的活性氧自由基的损害。硫氧还蛋白系统包括硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和NADPH,是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统,广泛地存在于真核生物和原核生物中。硫氧还蛋白系统与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长密切相关。其中,硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶。主要功能是催化NADPH将小分子蛋白硫氧还蛋白上的二硫键（-S-S）还原成（-SH）2的反应,维持Trx的还原型,可以维持细胞自由基产生和清除之间的平衡,在微生物适应环境及细菌致病性方面发挥重要作用。本文从致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi） SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶基因的1133 bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple,测序结果表明,目的片段含有960 bp的硫氧还蛋白还原酶基因阅读框,编码319个氨基酸残基的蛋白质。BLAST分析显示氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列相似性为分别为99%、98%、96%、94%、92%,该基因被命名为trxR。构建表达质粒pET-28a（+）/trxR后转化至大肠杆菌（E.coli） BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子量为34 kDa。用Ni琼脂糖亲和柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆,直接ELISA法检测了1-4周特异性抗体的效价。结果表明,1-4周内特异性抗体效价持续升高,达到log27.0。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1进行人工感染,对照组的死亡率为100%,免疫组的死亡率为25%,免疫保护率为75%。表明哈维氏弧菌TrxR蛋白具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 哈维氏弧菌
• 1.1.1 哈维氏弧菌的生物学性质
• 1.1.2 哈维氏弧菌的致病症状和病理变化
• 1.1.3 哈维氏弧菌的致病机制
• 1.1.4 哈维氏弧菌病的防治
• 1.1.5 哈维氏弧菌疫苗研究
• 1.2 硫氧还蛋白还原酶
• 1.2.1 TrxR的种类及结构
• 1.2.2 TrxR的功能
• 1.2.2.1 催化氧化还原活性
• 1.2.2.2 防御氮氧化应激
• 1.2.2.3 细胞的生长调节
• 1.2.3 硒对硫氧还蛋白系统的影响
• 1.3 本文的研究意义
• 2 哈维氏弧菌trxR基因的克隆、表达、及其免疫原性研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 哈维氏弧菌trxR基因的克隆
• 2.2.1.1 哈维氏弧菌基因组DNA的提取
• 2.2.1.2 引物的设计及合成
• 2.2.1.3 基因的PCR扩增
• 2.2.1.4 扩增产物的检测及纯化
• 2.2.1.5 PCR产物克隆质粒的构建及序列测定
• 2.2.1.6 感受态细胞的制备
• 2.2.1.7 重组质粒的转化
• 2.2.1.8 克隆质粒DNA提取
• 2.2.1.9 PCR产物克隆质粒的鉴定
• 2.2.2 哈维氏弧菌SF-1 trxR基因的表达
• 2.2.2.1 表达引物的设计与合成
• 2.2.2.2 哈维氏弧菌trxR基因的PCR扩增
• 2.2.2.3 pET-28a（+）/trxR表达质粒的构建及鉴定
• 2.2.2.4 trxR在大肠杆菌BL21中的表达
• 2.2.2.5 trxR表达条件的优化
• 2.2.2.6 trxR的SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.3 重组硫氧还蛋白还原酶TrxR的纯化
• 2.2.3.1 重组菌BL21（DE3）/pET28a（+）/trxR的诱导及培养
• 2.2.3.2 从菌体中纯化重组TrxR蛋白
• 2.2.3.3 Ni琼脂糖亲和柱亲和层析
• 2.2.3.4 Ni琼脂糖亲和柱的处理与再生
• 2.2.3.5 重组TrxR蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.4 重组TrxR蛋白对大菱鲆免疫效果的研究
• 2.2.4.1 重组TrxR蛋白大量表达和纯化
• 2.2.4.2 重组TrxR蛋白的浓度检测
• 2.2.4.3 实验动物处理及免疫
• 2.2.4.4 免疫牙鲆血清中抗体水平测定
• 2.2.4.5 重组TrxR蛋白对牙鲆的免疫保护效果
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 哈维氏弧菌trxR基因的克隆
• 2.3.2 哈维氏弧菌trxR基因在大肠杆菌中的表达及纯化
• 2.3.3 重组蛋白TrxR对大菱鲆的免疫保护效果
• 2.3.4 TrxR免疫对大菱鲆的特异性抗体变化规律
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录