高产乳链菌肽菌种选育及发酵培养基优化

论文摘要

乳链菌肽作为一种天然防腐剂,在乳制品、肉制品、罐头产品、饮品等行业中有广泛应用。相比于化学防腐剂,具有高效、安全、无毒、易被人体内消化酶降解,从而在体内无蓄积等诸多优势,然而乳链菌肽效价低、生产成本高等因素限制了乳链菌肽的广泛使用。目前,为了提高乳链菌肽的效价,人们对乳链菌肽培养基优化和发酵过程优化进行了大量的研究。本研究通过对实验室保存的乳链菌肽生产菌株Lactococcus lactis subsp. lactis W28进行紫外线诱变处理,通过乳链菌肽耐受平板法、葡萄糖耐受平板法以及双重抗性筛选法获得乳链菌肽高产突变菌株,并通过摇瓶发酵实验进行复筛,最终选育得到四株遗传稳定性好、乳链菌肽效价高的突变菌株,为GNK-1、GNK-4、SNK-5、SNK-10,四株菌中耐受nisin的最大浓度为7000IU/mL,葡萄糖为15%,其乳链菌肽效价分别为2200IU/mL、2105IU/mL、2274IU/mL、2178IU/mL,较原始菌株分别提高了1.90、1.81、1.96、1.88倍。以紫外诱变获得的乳链菌肽高产菌株GNK-1、GNK-4、SNK-5、SNK-10作为融合亲本,进行Genome Shuffling,提高乳酸链球菌对乳链菌肽的耐受水平。通过高浓度乳链菌肽（8000IU/mL）和高浓度葡萄糖（15%）对融合细胞进行初筛,以摇瓶发酵实验进行复筛,得到乳链菌肽效价高的融合子F2、F6,乳链菌肽效价能够达到2426IU/mL、2525IU/mL,较原始菌株提高了2.09倍和2.17倍。为了降低生产成本,采用菌糠处理液作为乳链菌肽生产菌的培养基质。实验首先对菌糠进行稀硫酸预处理,获得实验原料菌糠处理液。本研究主要考察了处理液的离子浓度、不同碱液回调处理液pH值对乳酸链球菌生长以及乳链菌肽效价的影响,发现当采用Ca（OH）2调节pH值的处理液原液培养乳酸链球菌时,菌体生长最好,菌体密度可达2.9×1011cfu/mL,只是乳链菌肽效价变化不明显。本研究对以菌糠处理液生产乳链菌肽培养基进行了优化,确定了最适补加碳源、氮源、磷酸盐分别为蔗糖、酵母膏、玉米浆、KH2PO4,其最适补加浓度分别为3g/L、7g/L、3g/L、1g/L,此时乳链菌肽效价为335IU/mL,较仅以菌糠处理液为培养基质提高了23%。为乳链菌肽的生产开发了一种新的廉价原料,同时使菌糠得到了有效利用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳链菌肽的研究历史
• 1.2 乳链菌肽的化学结构和理化性质
• 1.2.1 乳链菌肽的化学结构
• 1.2.2 乳链菌肽的理化性质及稳定性
• 1.2.3 乳链菌肽的使用标准与安全性
• 1.3 乳链菌肽的抗菌谱和抑菌机制
• 1.3.1 乳链菌肽的抗菌谱
• 1.3.2 乳链菌肽的抑菌机制
• 1.4 乳链菌肽检测技术的发展
• 1.4.1 琼脂扩散法（ADA, Agar Diffusion Assay）
• 1.4.2 浊度法（Turbidity Assays）
• 1.4.3 分光光度法
• 1.5 乳链菌肽发酵工艺研究
• 1.5.1 乳链菌肽发酵培养基优化
• 1.5.2 乳链菌肽发酵条件优化
• 1.6 菌种选育技术在乳链菌肽生产中的应用
• 1.6.1 传统诱变育种在乳链菌肽生产中的应用
• 1.6.2 Genome Shuffling技术在乳链菌肽生产中的应用
• 1.7 乳链菌肽的应用及发展前景
• 1.7.1 乳链菌肽在乳制品中的应用
• 1.7.2 乳链菌肽在肉制品中的应用
• 1.7.3 乳链菌肽在罐头制品中的应用
• 1.7.4 乳链菌肽在饮料中的应用
• 1.7.5 乳链菌肽的发展前景
• 1.8 本课题的立题依据与研究内容
• 第二章 乳链菌肽高产菌株的选育
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 药品与试剂
• 2.2.4 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 出发菌株发酵培养
• 2.3.2 乳链菌肽效价检测
• 2.3.3 出发菌株的第一轮紫外诱变
• 2.3.4 乳链菌肽高产菌株的筛选
• 2.3.5 第二轮紫外诱变
• 2.3.6 紫外诱变nisin高产菌株的遗传稳定性
• 2.3.7 Genome Shuffling选育乳链菌肽高产菌株
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 乳链菌肽标准曲线的绘制
• 2.4.2 乳酸链球菌生长曲线的测定
• 2.4.3 发酵过程中菌体密度、pH值以及乳链菌肽效价的变化
• 2.4.4 致死曲线的绘制
• 2.4.5 出发菌株对乳链菌肽和葡萄糖的耐受水平
• 2.4.6 第一轮紫外诱变突变菌株的复筛结果
• 2.4.7 乳链菌肽、葡萄糖双重抗性突变菌株的筛选
• 2.4.8 第二轮紫外诱变突变菌株的筛选结果
• 2.4.9 紫外诱变获得nisin高产突变菌株的遗传稳定性
• 2.4.10 Genome Shuffling选育乳链菌肽高产菌株
• 2.5 本章 小结
• 第三章 菌糠发酵产乳链菌肽
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 原料与菌株
• 3.2.2 仪器与设备
• 3.2.3 药品与试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌糠成分分析
• 3.3.2 菌糠预处理
• 3.3.3 菌糠处理液培养乳酸链球菌
• 3.3.4 利用菌糠处理液生产乳链菌肽发酵培养基优化
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 菌糠成分分析
• 3.4.2 菌糠处理液培养乳酸链球菌
• 3.4.3 利用菌糠处理液生产乳链菌肽发酵培养基优化
• 3.5 本章 小结
• 第四章 总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢