氰戊菊酯和甲氰菊酯酶联免疫吸附测定方法的研究

论文摘要

拟除虫菊酯类农药的大量使用,带来了食品安全和环境污染多方面问题。为探讨拟除虫菊酯类农药的免疫化学特性和建立其免疫分析方法,本文选择了两个代表性的拟除虫菊酯品种—氰戊菊酯和甲氰菊酯为研究对象,建立了氰戊菊酯的间接竞争性ELISA方法。利用戊菊酸和α-氰基-3-苯氧基苄醇设计和合成了氰戊菊酯的包被半抗原FVa和免疫半抗原FVb。通过碳二亚胺法将FVb和牛血清蛋白（BSA）偶联制备免疫原（FVb-BSA）,通过混合酸酐法将FVa和卵清蛋白偶联（OVA）制备包被原（FVa-OVA）,紫外扫描结果表明偶联成功,结合比分别为35:1和10:1。将免疫原免疫新西兰大白兔获得了氰戊菊酯的兔抗血清,间接非竞争ELISA法测得抗血清效价为1.28×104;将抗血清纯化获得抗体,冷冻干燥得冻干粉,效价为1×105。通过对pH值、离子强度、甲醇含量等影响因素进行的研究,确定pH7.5,0.3M钠离子强度的磷酸缓冲液和30%的甲醇为氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附测定分析方法的最佳工作条件,该方法的IC50为1.19mg/L,最低检测限为0.017mg/L,方法对大部分拟除虫菊酯,如甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯和联苯菊酯没有明显的交叉反应。向水中添加氰戊菊酯（0.1～5mg/L）,用该ELISA分析方法检测,添加回收率为83.5%～110.2%。利用甲氰菊酸（2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸）和α-氰基-3-苯氧基苄醇设计和合成了甲氰菊酯的包被半抗原FPa和免疫半抗原FPb。通过碳二亚胺法将FPb和牛血清蛋白（BSA）偶联制备免疫原（FPb-BSA）,通过混合酸酐法将FPa和卵清蛋白偶联（OVA）制备包被原（FPa-OVA）,紫外扫描结果表明偶联成功,结合比分别为38:1和15:1。将免疫原免疫新西兰大白兔获得了甲氰菊酯的兔抗血清,间接非竞争ELISA法测得抗血清效价为1.28×105;将抗血清纯化获得抗体,冷冻干燥得冻干粉,效价为5.12×105。但是抗体对甲氰菊酯没有明显的特异性,对其它的拟除虫菊酯类农药也没有明显的特异性;但对FPb有一定的特异性,IC50为9.33mg/L。比较所获得的氰戊菊酯和甲氰菊酯的抗体,甲氰菊酯的抗体效价比氰戊菊酯的要高,但是用ELISA法检测农药时,氰戊菊酯的抗体的特异性及灵敏度明显要好于甲氰菊酯的抗体。二者半抗原的设计和合成思路相同,乳化和免疫方法相同,却得到了不同的结果,其原因有待于进一步的研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1. 拟除虫菊酯类农药残留及代谢
• 1.1 农药残留的概念
• 1.2 拟除虫菊酯类农药的残留
• 1.3 拟除虫菊酯类农药的代谢
• 1.4 拟除虫菊酯类农药残留分析的研究进展
• 1.4.1 样品前处理方法
• 1.4.2 检测方法
• 2. 农药酶联免疫吸附测定（ELISA）法的研究进展
• 2.1 抗体的制备
• 2.1.1 抗体的结构
• 2.1.2 半抗原的设计与合成
• 2.1.3 人工抗原的合成
• 2.1.4 抗体的制备
• 2.2 农药酶联免疫分析方法的建立
• 2.2.1 用于农药分析的酶联免疫方法（ELISA）的类型
• 2.2.2 酶联免疫方法（ELISA）测定条件的优化
• 2.2.3 酶联免疫方法（ELISA）的样品制备和基质影响
• 2.2.4 酶联免疫分析技术质量控制
• 3. 拟除虫菊酯类农药半抗原设计与酶联免疫研究进展
• 3.1 拟除虫菊酯酸部分或醇部分修饰设计合成半抗原
• 3.2 拟除虫菊酯环丙烷部分修饰设计合成半抗原
• 3.3 拟除虫菊酯芳环部分修饰设计合成半抗原
• 3.4 拟除虫菊酯氰基部分修饰设计合成半抗原
• 4. 本研究的目的和意义
• 第二章 氰戊菊酯的ELISA方法研究
• 第一节 氰戊菊酯半抗原的合成
• 1. 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 结果分析
• 2.1 半抗原FVb的结构鉴定
• 2.2 分析讨论
• 第二节 抗体的制备及ELISA检测
• 1. 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 免疫抗原与包被抗原的紫外图谱鉴定与结合比估算
• 2.2 多克隆抗体的制备及效价测定
• 2.3 抗体的异源分析
• 2.4 ic-ELISA分析条件的优化
• 2.5 氰戊菊酯标准曲线的建立和交叉反应率的测定
• 2.6 水中氰戊菊酯的添加回收率
• 第三节 讨论
• 1. 半抗原的设计与合成
• 2. 抗体的ic-ELISA分析条件的优化
• 3. 抗体的特异性分析
• 第三章 甲氰菊酯的ELISA方法研究
• 第一节 甲氰菊酯半抗原的合成
• 1. 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 结果分析
• 2.1 半抗原FPb的鉴定
• 2.2 分析讨论
• 第二节 抗体制备及ELISA检测
• 1. 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2. 结果分析
• 2.1 免疫抗原与包被抗原的紫外图谱鉴定与结合比估算
• 2.2 多克隆抗体的制备及效价测定
• 2.3 抗体的检测
• 第三节 讨论
• 1. 半抗原的设计与合成
• 2. 抗体的检测及评价
• 全文主要结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢