膀胱癌分子分型和分子网络的系统生物学研究

论文摘要

在手术前对非浸润性和浸润性膀胱尿路上皮癌进行准确的区分对于制定正确的治疗方案至关重要；然而,目前临床尚缺乏有效的鉴别诊断方法。本研究利用微阵列比较基因组杂交（array comparative genome hybridization, array CGH）技术研究膀胱癌的基因组DNA拷贝数变化,旨在获得膀胱癌特征性DNA拷贝数变异谱型,通过构建分子模型来对非浸润性和浸润性膀胱癌进行分子分型。在获得膀胱癌的基因组DNA拷贝数变异谱型的基础上,对同一组膀胱癌组织样品进行mRNA表达谱和miRNA表达谱的并行分析,从这三组分析数据中挖掘三种分子层面的相关性改变,构建分子网络并初步探讨其在膀胱癌发生发展中的意义。本课题第一部分工作是应用Agilent公司的4x44K array CGH芯片分析了45例膀胱癌组织基因组DNA。结果显示,染色体变化主要发生在1p、1q、2q、4q、5q、6q、8p、8q、9p、9q、10q、11p、11q、13q、14q、17p、20q等染色体臂。将这批数据与本实验室前期工作中的膀胱癌1x44K array CGH芯片数据整合,运用R Project分析软件,从共计65例膀胱癌（非浸润性膀胱癌29例,浸润性膀胱癌36例）的array CGH数据中鉴定出一组在膀胱癌基因组中有较高频率拷贝数变异的染色体区域,并且得到29个在Ta-T3期膀胱癌组间有显著差异的DNA拷贝数变异片段（p<0.05）。采用回归分割决策树的方法,构建了一个由5个DNA片段（分别定位于染色体lp36.13、lq32.1、5q11.2、9q21.31-q21.33和9q33.2）组成的树状模型,该模型对非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的分型准确率达90.8%。随后用leave one out算法对上述29个差异片段进行交叉验证。用real-timePCR的方法分别在array CGH分析所用起始膀胱癌样本（57例）和独立样本组织（49例）中验证了分子分型模型中包含的9个基因（Al4P 103301、FAM131C CH1T1 CDC20B、RASEF、RMI1、DAPK1、TRAF1和C5）的拷贝数变异情况,从而明确了array CGH结果的可靠性,以及分型模型的可行性。本课题第二部分工作应用Agilent公司mRNA表达谱芯片和niRNA表达谱芯片分别对35例和32例膀胱癌组织进行了分析。结果显示,非浸润性和浸润性膀胱癌的mRNA表达谱之间存在772个差异表达基因,GO注释发现这些差异表达基因均与细胞外基质有关；非浸润性和浸润性膀胱癌的miRNA表达谱之间存在146个差异表达的miRNA,对差异最显著的5个miRNA进行靶基因预测,并对这些靶基因进行GO分析,发现靶基因主要与代谢相关。本研究中有30例膀胱癌样品并行完成了array CGH芯片、mRNA表达谱和miRNA表达谱芯片分析。通过WGCNA （Weighted correlation network analysis）算法鉴定出11个与肿瘤浸润程度相关的“基因模块’’（module）,基于GSEA （Gene Set Enrichment Analysis）方法得到信息以及eQTL （expression Quantitative Trait Locus）分析方法研究膀胱癌基因组DNA拷贝数变异与转录组改变之间的关系,针对每个module构建整合有DNA、mRNA、miRNA三个层面信息的分子网络,并初步探讨其内在的生物学意义。本研究结果表明,非浸润性和浸润性膀胱癌基因组DNA拷贝数的改变确实存在差异,据此通过生物信息学方法构建的分子模型能够比较准确地区分两型膀胱癌,并且在独立样本中得到了证实。而运用系统生物学方法构建的与膀胱癌浸润程度相关的分子网络,则为深入研究膀胱癌的发生发展机制提供了大量信息和宝贵的线索。

论文目录

• 图表索引
• 英文缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 导论
• 一、膀胱癌的概述
• 二、基因芯片技术及其应用
• 1. 基因芯片的种类
• 1.1 用于分析基因组结构改变
• 1.2 用于分析基因组功能改变
• 2. 基因芯片技术在肿瘤研究与临床实践中的应用
• 3. 利用基因芯片数据进行系统生物学的研究
• 3.1 系统生物学的概述
• 3.2 基因芯片在系统生物学研究中的应用
• 三、膀胱癌相关基因组结构与功能改变的研究
• 1. 膀胱癌相关基因组结构的异常改变
• 2. 膀胱癌相关基因组功能的异常改变
• 3. 膀胱癌的系统生物学研究
• 四、问题与展望
• 五、本课题的研究目的和研究策略
• 第二章 以DNA拷贝数改变鉴别非浸润性与浸润性膀胱癌的研究
• 一、结果
• 1. 膀胱癌组织的array CGH分析
• 1.1 获得高质量基因组DNA
• 1.2 酶切gDNA
• 1.3 gDNA的标记、纯化以及与基因芯片杂交
• 1.4 杂交后芯片数据的提取
• 2. 膀胱癌组织array CGH实验数据分析
• 2.1 45例膀胱癌组织中gDNA异常改变情况
• 2.2 65例膀胱癌样品基因组DNA变化情况
• 2.2.1 芯片数据均一化
• 2.2.2 基因组DNA拷贝数改变情况
• 2.2.3 对array CGH芯片分析结果的组织样品验证
• 3. 对65例膀胱癌进行分子分型
• 3.1 不同临床分期的膀胱癌组间基因组DNA变化的差异分析
• 3.2 以主成分分析区分Ta-T3期膀胱癌
• 3.3 回归分割决策树构建非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌分子分型模型
• 3.4 膀胱癌相关DNA拷贝数变异的进化分析
• 4. 非浸润性和浸润性膀胱癌分子分型模型的验证
• 4.1 针对差异片段的交叉验证分析
• 4.2 采用膀胱癌组织样品的验证
• 4.2.1 针对用于array CGH分析样品的real-time PCR验证
• 4.2.2 针对膀胱癌独立样本的real-time PCR验证
• 二、讨论
• 1. 实验的质量控制
• 1.1 临床相关入组样品的质量控制
• 1.2 实验操作过程中的质量控制
• 2. 膀胱癌基因组DNA的改变
• 2.1 高分辨率array CGH芯片
• 2.2 array CGH结果的验证
• 2.3 膀胱癌基因组DNA的改变情况
• 2.4 膀胱癌基因组变异的进化分析
• 3. 非浸润性与浸润性膀胱癌基因组DNA变化的差异
• 3.1 构建区分非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱癌的分型模型
• 3.2 分型模型的验证
• 本章小结
• 第三章 膀胱癌相关分子网络的系统生物学研究
• 结果
• 1. 膀胱癌组织mRNA表达谱的获得
• 1.1 mRNA表达谱芯片的杂交分析
• 1.1.2 杂交后mRNA表达谱芯片的扫描和数据的提取
• 1.1.3 mRNA表达谱芯片数据的质量控制
• 1.1.4 mRNA表达谱芯片原始数据标准化
• 1.2 膀胱癌mRNA表达谱数据分析
• 1.2.1 差异表达基因的筛选
• 1.2.2 差异表达基因的功能注释
• 2. 膀胱癌组织miRNA表达谱的获得
• 2.1 miRNA表达谱芯片的杂交分析
• 2.1.1 从被测组织样品中获得高质量的RNA
• 2.1.2 杂交后miRNA表达谱芯片的扫描和数据的提取
• 2.1.3 miRNA表达谱芯片数据的质量控制
• 2.1.4 miRNA表达谱芯片原始数据标准化
• 2.2 膀胱癌miRNA表达谱数据分析
• 2.2.1 差异表达miRNA的筛选
• 2.2.2 差异表达miRNA的靶基因预测及分析
• 3. 针对DNA、mRNA和miRNA芯片数据的整合分析
• 3.1 差异mRNA表达分析
• 3.2 加权基因共表达分子网络分析
• 3.2.1 聚类分析确定不同的module
• 3.2.2 不同module与膀胱癌临床分期的关系
• 3.2.3 基因集富集分析
• 3.3 表达数量性状基因座分析
• 3.4 分子网络的整合分析
• 二、讨论
• 1. 临床相关入组样品的质量控制
• 2. 膀胱癌mRNA表达谱的改变
• 3. 膀胱癌miRNA表达谱的改变
• 3.1 miRNA芯片的质量控制
• 3.2 非浸润性膀胱癌与浸润性膀胱癌的差异miRNA表达谱
• 4. 整合分析的实验设计
• 5. 分子网络的构建
• 5.1 确定高度相关的基因群（module）
• 5.2 基因富集分析
• 5.3 构建分子网络（network）
• 5.4 eQTL分析
• 5.5 eQTL与分子网络的整合
• 本章小结
• 第四章 材料与方法
• 一、实验材料
• 1. 膀胱癌患者及其组织样品
• 1.1 新鲜冻存膀胱癌组织
• 1.2 甲醛固定石蜡包埋组织
• 2. 主要试剂
• 2.1 生物样品收集、制备和鉴定所需试剂
• 2.2 微陈列比较基因组杂交分析主要试剂（盒）
• 2.3 mRNA表达谱分析主要试剂（盒）
• 2.4 miRNA表达谱分析主要试剂（盒）
• 2.5 实时定量PCR试剂（盒）与引物
• 2.5.1 试剂（盒）
• 2.5.2 引物序列
• 3. 主要仪器
• 二、实验方法
• 1. 基因组DNA提取
• 1.1 新鲜冻存膀胱癌组织DNA提取
• 1.2 甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取
• 1.2.1 去除石蜡
• 1.2.2 蛋白酶K处理
• 1.2.3 基因组DNA提取
• 1.3 尿脱落细胞DNA提取
• 1.4 鉴定基因组DNA完整性
• 2. 总RNA样品的制备与鉴定
• 2.1 提取新鲜冻存膀胱癌组织标本总RNA
• 2.2 总RNA样品的纯化
• 2.3 RNA样品的质量鉴定
• 3. 微阵列比较基因组杂交
• 3.1 限制性酶切基因组DNA
• 3.2 荧光标记酶切后的基因组DNA样品
• 3.3 纯化标记后的基因组DNA
• 3.4 基因组DNA样品与芯片的杂交
• 3.5 杂交后的芯片清洗
• 3.6 杂交后的芯片扫描
• 3.7 数据获取
• 4. 利用基因芯片检测mRNA表达谱
• 4.1 配制单色Spike-in溶液
• 4.2 荧光标记样品mRNA
• 4.3 纯化标记后的产物cRNA
• 4.4 纯化后的cRNA的定量和质控
• 4.5 mRNA表达谱芯片杂交
• 4.6 杂交后的芯片清洗
• 4.6.1 制备洗液
• 4.6.2 芯片清洗
• 4.7 芯片扫描和图像数据提取
• 4.8 数据获取
• 5. 利用基因芯片检测miRNA表达谱
• 5.1 荧光标记总RNA
• 5.1.1 总RNA去磷酸化
• 5.1.2 样品变性
• 5.1.3 荧光标记样品
• 5.2 干燥标记后的样品
• 5.3 miRNA表达谱芯片杂交
• 5.3.1 准备杂交样品
• 5.3.2 芯片杂交
• 5.4 杂交后的芯片清洗
• 5.4.1 制备洗液
• 5.4.2 清洗芯片
• 5.5 芯片扫描和图像数据提取
• 5.6 数据获取
• 6. 实时荧光定量PCR分析
• 6.1 实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件
• 6.2 绘制标准曲线
• 6.3 样品检测
• 7. 统计学分析
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 个人简历