辽宁省稻瘟病菌对烯肟菌酯的抗药性及其分子机制研究

论文摘要

由于稻瘟病菌对常用杀菌剂抗药性的产生,大大降低了化学防治稻瘟病菌的效果。本研究着重从稻瘟病菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂-烯肟菌酯的敏感性测定、抗烯肟菌酯突变体的诱导、抗药性突变体生物学特性、交互抗药性的测定以及抗性机制等方面进行研究,旨在初步评价稻瘟病菌对杀菌剂烯肟菌酯的抗药性风险,并为烯肟菌酯的科学使用和稻瘟病菌对烯肟菌酯产生抗药性后抗药性治理策略的制定提供理论依据。敏感性测定:采用菌落生长速率法就稻瘟病菌对烯肟菌酯的抗药性进行了测定,共监测采自辽宁省8个地区的稻瘟病菌菌株151株。监测结果表明该省8个地区的稻瘟病菌对烯肟菌酯的敏感性基线为1.3772μg·mL-1。不同的稻瘟病菌菌株对烯肟菌酯的敏感性存在一定的差异,EC50值在0.6567-1.9375μg·mL-1之间,EC50值相差2.9504倍。并未发现抗药性菌株的产生。同一年份采集的不同地区菌株间的EC50值差异不显著。三年采自不同地区的稻瘟菌株对烯肟菌酯存在一定差异,其中,最敏感的是抚顺菌株,其EC50平均值为1.2613μg·mL-1;最不敏感的是营口菌株,其EC50值为1.5264μg·mL-1。生物活性测定:检测烯肟菌酯对敏感菌株B2的生长速率、产孢量、对黑色素的形成的影响、通过喷雾和浸根的方式测定保护和治疗活性。水杨肟酸、抗坏血酸和甘露醇对稻瘟病菌生长的抑制作用。试验结果表明,烯肟菌酯能抑制菌丝生长和孢子的产生,对黑色素合成没有显著影响;盆钵试验表明烯肟菌酯对稻瘟病菌有良好的保护和治疗作用。抗药性诱导:通过紫外线、药剂诱导、药剂驯化和紫外线、药剂驯化联合驯化的方法对最敏感菌株进行抗药性诱变。共获得了10个抗药性菌株编号分别为MRA5-f、MRB2-f、MRB6-f、MRC4-f、MRF3-f、MRF8-f、LRB6-f、LRF8-f、LRF3-UV+f、LRA5-UV+f。药剂紫外光联合诱导的方法获得了2株低抗菌株,其抗药性倍数分别为14.14和12.10。药剂单独驯化获得的6株抗药性突变体抗性倍数较高属于中等抗药性水平,其中MRB6-f的抗性倍数最高为27.24倍。药剂诱导获得2株低抗菌株,编号为LRB6-f、LRF8-f。结果表明紫外线和药剂联合诱导和药剂驯化都可以获得抗药性菌株,且后者强于前者。生物学特性研究:菌丝生长速率:采用培养皿菌落直径法测定稻瘟菌菌株菌落直径,计算菌落生长速率;产孢量:将菌株菌丝块（6mm）两块分别移至高粱粒培养基的小三角瓶里,相同条件培养后,比较抗性菌株和敏感菌株的产孢能力的差异;菌丝鲜重的比较;竞争力的差异:为了更确切地评价烯肟菌酯抗药性菌株的适合度,通过活体盆栽试验,测定了抗药性菌株与敏感菌株的竞争力。将抗性菌株与敏感菌株的分生孢子分别按1∶1比例混合对水稻苗进行接种,以单独接种抗性菌株和敏感菌株作对照,培养8-10d后调查计算病情指数,比较抗性菌株与敏感菌株致病力;渗透敏感性的测定（包括不同的NaCl浓度、不同的葡萄糖浓度及温度条件的影响）;遗传稳定性及产毒能力的比较。试验结果如下:抗药性菌株和敏感菌株的生长速率在P=0.01水平上差异极显著。各菌株的菌丝生长速度与相应菌株的EC50值相关系数为0.7847,达到了0.01的显著水平。各敏感菌株和抗药性菌株的产孢量在P=0.01水平上差异极显著。但产孢量和EC50值之间无相关性。菌丝鲜重与EC50值之间存在相关性。将敏感菌株与抗性菌株混合孢子接种与单独接种敏感菌株孢子以及单独接种抗性菌株孢子的处理之间差异均达到了5%的显著水平,说明稻瘟病菌株的抗性孢子致病力较差。可以推断在田间出现抗性菌株时,抗药菌株也难以形成优势种群。遗传稳定性试验结果表明所有的抗性菌株在无药培养基上连续转移,抗性菌株的抗药性明显下降,都不能以无性繁殖稳定的遗传。从渗透敏感性的试验结果可以初步判断稻瘟病菌随着抗药性类型与渗透敏感性之间存在相关性。在相同渗透压条件下,敏感菌株比抗药性菌株的生长速率快,表明敏感菌株的渗透调节能力好于抗药突变体。越敏感菌株,菌丝生长越快。敏感菌株的产毒能力较强,以F3为例,敏感菌株F3的EC50为30.3592μg·mL-1,抗药性菌株MRF3的EC50为50.3925μg·mL-1,LRF3的EC50为42.5826μg·mL-1。交互抗药性测定:为了明确烯肟菌酯与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和其它类杀菌剂之间是否存在交互抗药性。分别测定咪鲜胺、嘧菌酯、醚菌酯、富士一号、多菌灵、三环唑、稻瘟净这七种药剂对烯肟菌酯的敏感与抗性菌株的EC50值,并将各菌株对烯肟菌酯的EC50值与上述7种药剂的EC50值分别作相关性分析。结果表明:稻瘟病菌对烯肟菌酯与醚菌酯和嘧菌酯EC50值的相关系数在P=0.05水平上显著,说明烯肟菌酯与之间存在交互抗药性。稻瘟病菌对烯肟菌酯与三环唑、多菌灵、稻瘟净、咪鲜胺和富士一号EC50值的相关系数分别为0.4468、0.5531、0.5682、0.4177和0.5463,在P=0.05水平上差异不显著,说明烯肟菌酯与三环唑、多菌灵、稻瘟净、咪鲜胺和富士一号之间不存在交互抗药性。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂属于高风险杀菌剂,极易产生抗性。导致甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗性的主要原因是G143A即cyt b基因143位的甘氨酸突变为丙氨酸（G143A）和F129L,即129位点的苯丙氨酸被亮氨酸所取代（F129L）。本实验研究了烯肟菌酯的抗性分子机制,通过设计特异性引物,进行PCR扩增和克隆。得到了对烯肟菌酯敏感的菌株以及在室内药剂驯化对烯肟菌酯产生抗性的突变体cyt b基因的部分核苷酸和氨基酸序列。3株敏感菌株核苷酸对比有两处不同,但转化成氨基酸确完全相同,未引起氨基酸位点发生突变。又将敏感菌株与室内经烯肟菌酯药剂驯化获得的中抗菌株的氨基酸序列进行比对分析。供试的三个抗药性突变体都在129位由苯丙氨酸F（TTT）突变为亮氨酸L（TTA）。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂作用位点单一,产生抗药性的突变位点主要有两个即143位点上的甘氨酸突变为丙氨酸（G143A）,129位点的苯丙氨酸被亮氨酸所取代（F129L）。本章测序的结果符合之前报道过的突变位点即（F129L）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的研究进展与杀菌剂抗性检测技术
• 1.1 甲氧基丙烯酸酯类农药的研究与开发
• 1.1.1 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的发现和开发简介
• 1.1.2 作用特性
• 1.1.3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用机制
• 1.1.4 影响病原菌对其产生抗性的突变因素
• 1.1.5 病原菌对杀菌剂的抗性机制
• 1.1.6 抗性的发生
• 1.1.7 杀菌剂抗性的治理
• 1.1.8 市场预测与产量质量收益
• 1.2 杀菌剂抗性检测技术
• 1.2.1 等位基因特异性扩增
• 1.2.2 限制性片段长度多态性
• 1.2.3 等位基因特异性寡核苷酸杂交
• 1.2.4 单链构象多态性
• 1.2.5 变性高效液相色谱分析
• 1.2.6 荧光实时定量PCR
• 1.3 本研究的目的与意义
• 1.4 展望与计划
• 第二章 稻瘟病菌对烯肟菌酯敏感性的测定与生物活性的研究
• 2.1 敏感性测定方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.2 烯肟菌酯对稻瘟病菌生物活性的研究
• 2.2.1.试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.3 本章小结
• 第三章 辽宁省稻瘟病菌对烯肟菌酯抗药性的诱变研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 稻瘟病菌对烯肟菌酯的抗药性诱变
• 3.2.2 种方法诱导的抗药性菌株的抗药性水平
• 3.3 本章小结
• 第四章 烯肟菌酯抗性突变体的生物学特性
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 生物学特性测定结果与分析
• 4.2.1 抗性菌株与敏感菌株生长速率测定结果
• 4.2.2 抗性菌株与敏感菌株产孢量比较结果
• 4.2.3 连续转代对抗性菌株产孢量的影响
• 4.2.4 菌丝鲜重的比较结果
• 4.2.5 抗性菌株遗传稳定性的比较
• 4.2.6 抗性菌株与敏感菌株竞争力的比较（活体试验）
• 4.2.7 抗性突变体渗透敏感性的测定
• 4.2.8 供试菌株产毒量对种子萌发的影响
• 4.3 本章小节
• 第五章 烯肪菌醋与三环哇等药剂的交互抗药性的测定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 抗性菌株和敏感菌株对咪鲜胺和嘧菌酯敏感性测定结果
• 50的相关性'>5.2.2 烯肟菌酯与咪鲜胺和嘧菌酯等八种药剂EC₅₀的相关性
• 5.3 本章小结
• 第六章 稻瘟病菌对烯肟菌酯抗药性机制研究
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 培养基
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 病原菌培养
• 6.2.2 病原菌预处理
• 6.2.3 基因组DNA的提取
• 6.2.4 PCR扩增
• 6.2.5 PCR产物的克隆和测序
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 基因组DNA的提取结果
• 6.3.2 不同来源的敏感菌株部分cyt b基因序列及氨基酸序列比对分析
• 6.3.3 敏感菌株与室内抗药性突变体之间部分cyt b基因序列及氨基酸序列比对分析
• 6.4 本章小节
• 第七章 结论与讨论
• 7.1 辽宁省稻瘟病菌对烯肟菌酯的敏感性测定
• 7.2 抗烯肟菌酯菌株的筛选及抗药性测定
• 7.3 生物学特性
• 7.4 交互抗药性的研究
• 7.5 稻瘟病菌对烯肟菌酯抗药性机制研究
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文