海洋酵母菌种资源库的建立及特殊类型海洋酵母菌的多样性研究

论文摘要

本实验室近年来从不同海洋环境中分离得到了551株酵母菌,经鉴定发现这些酵母菌分别属于22个属、58个种,并以此为基础建立了我国第一个海洋酵母菌种资源库,为每株酵母菌建立了电子档案。通过与中国海洋微生物菌种保藏管理中心合作实现了资源库内所有海洋酵母菌种的实物共享与信息共享,为研究者提供资源支撑平台。通过对本实验室保藏的海洋酵母菌种资源库中的酵母菌进行筛选,我们发现9株海洋酵母菌在含有橄榄油的培养基中能产脂肪酶。经过常规生理生化鉴定和分子生物学方法鉴定,这9株酵母菌分别属于间型假丝酵母（Candida intermedia）,季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）,近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）,长孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）,桔假丝酵母（Candida quercitrusa）,普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）,解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）,胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和褶皱假丝酵母（Candida rugosa）。这些酵母菌所产的脂肪酶的最适作用pH值介于6.0-8.5之间,最适作用温度分别为35℃和40℃。本研究中的大多数酵母菌产的脂肪酶是与细胞壁结合的,只有普鲁兰短梗霉HN2.3产的脂肪酶只胞外酶。一些酵母菌株产的脂肪酶可以高效地水解不同的油脂,这表明这些菌株在工业上具有潜在的应用价值。通过对本实验室保藏的海洋酵母菌种资源库中的酵母菌进行筛选,我们发现17株海洋酵母菌能够向培养基中分泌嗜杀因子,从而杀死梭子蟹的一种致病菌——二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidate）WCY。其中有5株酵母菌（WC91-2,gao1zhong2,YF07b,hcx-1和HN2.3）的嗜杀活力比较高。常规生理生化鉴定和分子生物学鉴定的结果表明,这5株酵母菌分别属于土星拟威尔酵母（Williopsis saturnus）,季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）,异常毕赤酵母（Pichia anomala）,汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和普鲁兰短梗霉（Aureobasidium pullulans）。我们发现并不是所有的嗜杀因子的最适生产条件和嗜杀因子的最适作用条件与海洋环境及梭子蟹的养殖环境条件相一致。我们还发现由这些酵母菌所产的嗜杀因子能够杀死除了致病酵母WCY之外的其他酵母菌,而且培养基中的NaCl浓度对嗜杀作用有影响。所有的由这些酵母菌所产的嗜杀因子粗酶液均可以水解海带多糖,水解的终产物均为单糖。我们发现从中国东海分离得到的一株海洋酵母菌W14-3能够产核黄素。有趣的是,这株海洋酵母菌在振荡培养的条件下在分别含有木糖、蔗糖、半乳糖和麦芽糖的培养基中能够分泌大量的核黄素。经过常规生理生化鉴定和分子生物学方法鉴定,这株酵母菌是膜醭假丝酵母（Candida membranifaciens）的一个新亚种——Candida membranifaciens subsp. flavinogenie。这株菌中与核黄素生物合成有关的4个基因（分别编码GTP去环化酶II、DRAP脱氨基酶、3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶及2,4-二氧四氢蝶啶合成酶）的部分序列被克隆,由这些基因序列推导出的氨基酸序列分别与其它酵母菌中的相关蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。培养基中存在Fe3+离子会抑制核黄素的合成并抑制核黄素生物合成途径中相关基因的转录。该实验结果证明了海洋酵母菌W14-3中存在核黄素生物合成途径。这是首个关于从海洋环境中分离得到的C. membranifaciens subsp. flavinogenie W14-3产核黄素的报道。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 海洋环境中的酵母菌分布和生物多样性
• 1.1 细胞密度
• 1.2 酵母菌在河口和红树林地区的分布
• 1.3 大洋和深海环境中酵母菌的分布
• 2 海洋酵母菌胞外酶及其基因研究进展
• 2.0 概述
• 2.1 脂肪酶
• 2.2 嗜杀因子
• 2.3 碱性蛋白酶
• 2.4 酸性蛋白酶
• 2.5 菊糖酶
• 2.6 纤维素酶
• 2.7 淀粉酶
• 2.8 植酸酶
• 2.9 小结
• 3 核黄素生物合成研究进展
• 3.0 概述
• 3.1 核黄素的工业生产
• 3.2 核黄素的生物合成
• 4 本论文的研究目的与意义
• 第二章 海洋酵母菌种资源库的建立
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 样品来源
• 1.2 海洋酵母的分离
• 1.3 海洋酵母的鉴定
• 1.4 海洋酵母菌种资源描述规范
• 2 结果
• 2.1 菌种保藏情况
• 2.2 菌种资源共享情况
• 2.3 菌种信息共享情况
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第三章 产脂肪酶的海洋酵母菌多样性研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 脂肪酶生产菌初筛培养基
• 1.3 脂肪酶发酵培养基
• 1.4 脂肪酶粗酶液的制备
• 1.5 脂肪酶活力测定
• 1.6 产脂肪酶的海洋酵母菌的常规生理生化鉴定及分子生物学鉴定
• 1.7 pH 与温度对脂肪酶活力的影响
• 1.8 脂肪酶水解油脂能力的测定
• 2 结果
• 2.1 产脂肪酶的海洋酵母菌的筛选
• 2.2 产脂肪酶的海洋酵母菌的菌落形态与细胞形态观察
• 2.3 产脂肪酶的海洋酵母菌的生理生化鉴定
• 2.4 18S rRNA 基因、26S rRNA 基因及ITS 序列对比及系统进化分析
• 2.5 温度与pH 对粗酶活力的影响
• 2.6 脂肪酶活力及与细胞壁结合的脂肪酶活力的测定
• 2.7 脂肪酶粗酶对油脂的水解作用
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第四章 海洋嗜杀酵母多样性研究
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 嗜杀酵母筛选培养基
• 1.3 嗜杀酵母的筛选
• 1.4 嗜杀酵母的常规生理生化鉴定及分子生物学鉴定
• 1.5 嗜杀酵母活性检测培养基
• 1.6 产嗜杀因子培养基
• 1.7 嗜杀酵母的发酵培养
• 1.8 嗜杀因子的浓缩
• 1.9 嗜杀因子抑菌活性的检测
• 1.10 嗜杀因子水解海带多糖的产物分析
• 2 结果
• 2.1 海洋嗜杀酵母的筛选结果
• 2.2 海洋嗜杀酵母的菌落形态与细胞形态观察
• 2.3 海洋嗜杀酵母的生理生化鉴定
• 2.4 18S rRNA 基因26S rRNA 基因及ITS 序列对比及系统进化分析
• 2.5 NaCl 浓度、温度和pH 值对海洋酵母菌发酵产生嗜杀因子的影响
• 2.6 NaCl 浓度、温度和pH 值对嗜杀因子抑菌作用的影响
• 2.7 嗜杀酵母杀菌谱的检测
• 2.8 嗜杀因子水解海带多糖的产物分析
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 第五章 分泌核黄素的海洋酵母新亚种 Candida membranifaciens subsp. flavinogenie W14-3 初步研究
• 0 前言
• 第一节 海洋酵母菌 W14-3 的鉴定及所产黄色物质的定性分析
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 产核黄素的培养基
• 1.3 核黄素的发酵生产
• 3+ 离子对核黄素发酵生产的影响'>1.4 Fe³⁺离子对核黄素发酵生产的影响
• 1.5 核黄素的定量测定
• 1.6 核黄素的部分纯化
• 1.7 高效液相色谱（HPLC）分析
• 1.8 海洋酵母 W14-3 的鉴定
• 2 结果
• 2.1 菌株 W14-3 的分离及黄色物质的产生
• 2.2 高效液相色谱（HPLC）定性分析黄色物质
• 2.3 海洋酵母菌株 W14-3 的常规鉴定
• 2.4 18S rRNA 基因、26S rRNA 基因及ITS 序列对比及系统进化分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 3+对部分基因转录的影响'>第二节 海洋酵母菌W14-3中核黄素生物合成相关基因的克隆及Fe³⁺对部分基因转录的影响
• 0 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 与核黄素生物合成有关的基因的部分克隆
• 3+ 离子对核黄素生物合成基因转录的影响'>1.3 Fe³⁺离子对核黄素生物合成基因转录的影响
• 2 结果
• 2.1 RIB1 基因的部分克隆
• 2.2 RIB2 基因的部分克隆
• 2.3 RIB3 基因的部分克隆
• 2.4 RIB4 基因的部分克隆
• 3+对菌株W14-3 中核黄素生物合成的2 个关键限速酶基因转录的影响'>2.5 Fe³⁺对菌株W14-3 中核黄素生物合成的2 个关键限速酶基因转录的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 总结
• 创新与展望
• 1 本论文的创新点
• 2 展望
• 参考文献
• 发表的学术论文
• 致谢