Notch信号通路参与心肌缺血/再灌注损伤及保护的研究

论文摘要

【研究背景】缺血性心脏病是危害人类健康的第一杀手,我国现有患者超过2000万人,且每年新增100万人左右。缺血性心脏病治疗核心是及时有效地恢复心肌血液供应。但缺血心肌组织恢复血液供应（再灌注）后常继发和加重心肌组织损伤,即缺血/再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury,I/RI）,是缺血性心脏病临床治疗效果不佳的主要原因之一。Notch信号通路是心血管系统发生、发育、病理和生理过程中基本信号通路之一。有研究表明:1)心梗后晚期Notch信号通路关键分子NICD（Notch-1分子胞内区）在心梗边缘区表达显著上升;2)Notch信号通路激活后显著改善心梗晚期心脏功能。但是Notch信号通路在心肌缺血/再灌注损伤急性期的作用及机制研究尚未见报道。【目的】1.阐明Notch信号通路相关分子NICD和Hes1在人心肌缺血/再灌注前后的变化规律。2.探索Notch信号通路对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的调节作用的及其具体机制。【方法】1.以体外循环心脏手术病人20例为研究对象,分别在体外循环前和心脏再灌注15分钟后,获取心肌标本,Western blotting检测Notch信号通路配体Notch1的胞内段（NICD）和下游分子Hes1的表达变化。2.以SD大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型为研究对象,分别在缺氧前用DAPT（Notch信号通路特异性抑制剂）和Jagged1蛋白（Notch信号通路的一种配体,可以激活Notch信号通路）处理。实验分为6组,分别为:对照组、SI/R、Jagged+DAPT+SI/R、Jagged1+SI/R、DAPT和Jagged1。DAPT和Jagged1在缺血再灌前1h加入培养液处理细胞达到激活或抑制Notch信号通路的目的,为了排除DAPT（31.25nM）或Jagged1（6.8μM）本身对心肌细胞影响,分别设置单独DAPT和Jagged1组。通过NICD对和Hes1的表达检测,心肌细胞活力检测,心肌细胞乳酸脱氢酶释放检测,心肌细胞凋亡检测和对Bcl2、Caspase3、NICD和Hes1的表达水平的检测,观察Notch信号通路抑制或激活后对心肌细胞缺氧/复氧损伤的调节作用。【结果】1.体外循环心脏手术中患者心肌的缺血/再灌注后,心肌组织中NICD和Hes1的Western blotting信号强度分别为缺血前的21.97%±8.45%和26.56%±6.59%（vs缺血前100%,P<0.01）。2. SD大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧后,NICD和Hes1表达下降,免疫荧光信号强度分别为缺氧前的25.39%±7.29%和30.97%±8.45%（vs缺氧前100%,P<0.01）;Western blotting信号强度分别为缺氧前的45.27±6.92%和44.98%±5.83%（vs缺氧前100%,P<0.01）。Jagged1+SI/R组与SI/R组比较:细胞活力显著升高（0.55±0.05 vs 0.42±0.06,P<0.05）;LDH释放率显著下降（28.32%±3.15% vs 36.25±3.29% ,P<0.05）;细胞凋亡指数显著下降（23.52%±13.47% vs 34.18%±3.51%,P<0.05）;NICD表达显著升高（61.12%±5.71% vs 45.27±6.92%,P<0.05）,Hes1表达显著升高（59.46%±3.85% vs 44.98%±5.83%,P<0.05）;Bcl2表达显著升高（69.25%±4.82% vs 53.65±3.85%,P<0.05）,Caspase3表达显著下降（126.21%±5.14% vs 216.64±8.21%,P<0.01）。Jagged1+DAPT+SI/R组与Jagged1+SI/R组比较:细胞活力显著下降（0.23±0.05 vs 0.55±0.05,P<0.01）;LDH释放率显著升高（49.63%±3.89% vs 28.32%±3.15%,P<0.01）;细胞凋亡指数显著升高（46.29±4.08% vs 23.52%±13.47%,P<0.01 ）;NICD表达显著下降（22.54±6.30% vs 61.12%±5.71% ,P<0.01）,Hes1表达显著下降（31.24%±4.33% vs 59.46%±3.85%,P<0.01 ）;Bcl2表达显著下降（39.45±4.12% vs 69.25%±4.82%,P<0.01）,Caspase3表达显著升高（165.64%±8.21% vs 126.21%±5.14% ,P<0.01）。单纯Jagged1或DAPT对心肌细胞细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡指数以及Bcl2和caspase3表达的影响没有统计学差异。【结论】1.我们的研究首次发现Notch信号通路相关分子Notch1和Hes1表达在人心肌缺血/再灌注后明显下降,提示Notch信号通路可能在人心肌缺血/再灌注损伤过程中起调控作用。2.在SD大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型上深入研究,进一步发现NICD和Hes1在心肌细胞缺氧/复氧损伤后表达明显下降,心肌细胞活力明显下降,乳酸脱氢酶释放明显增加,细胞凋亡显著增加。而应用Jagged1激活Notch信号通路后,Notch信号通路相关分子NICD和Hes1表达显著上升,并明显减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤;应用DAPT抑制Notch信号通路后,NICD和Hes1表达显著下降,并可明显加重缺氧/复氧损伤。从而首先证实Notch信号通路确实在心肌缺血/再灌注过程中发挥重要的调控作用,激活Notch信号通路具有抗缺血/再灌注损伤作用。我们的发现加深了对心肌缺血/再灌注损伤的机制的认识,为寻找新的抗心肌缺血/再灌注方法提供新的思路。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 一、心肌缺血/再灌注机制的研究进展
• 二、Notch 信号通路简介
• 三、Notch 信号通路在心脏中的作用
• 一、人心肌缺血/再灌注前后Notch 相关分子的表达变化
• 1. 实验材料和方法
• 2. 实验结果
• 二、SD 大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌注前后 Notch 相关分子表达变化
• 1. 实验材料和方法
• 2 实验结果
• 三、Notch 信号途径对心肌细胞缺血/再灌注损伤过程的调节作用
• 1. 实验材料和方法
• 2 实验方法
• 3. 实验结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢