论文摘要
脂肪是评价猪肉品质的一个关键指标,其中肌内脂肪含量直接影响猪肉的色泽、风味、嫩度、持水力等肉质指标,而皮下脂肪也直接关系到经济价值与肉用品质,如何在降低皮下脂肪沉积的同时增加肌内脂肪含量成为肉质调控的关键问题。我国地方优良地方品种猪金华猪肌内脂肪含量高、肉色红润,但是皮下脂肪含量高,生长缓慢。因此本研究以金华猪和肌内脂肪含量少且皮下脂肪薄的瘦肉型长白猪为试验动物模型,通过基因芯片技术、生物信息学分析技术获得金华猪和长白猪背最长肌以及皮下脂肪基因差异表达谱,筛选出差异表达基因pFAM134B,通过RACE克隆技术克隆得到新基因pFAM134B的cDNA全长,研究该基因在肝脏、大脑、背最长肌以及皮下脂肪中的表达差异及规律,并利用RNAi技术和基因超表达技术在转录水平上初步鉴定pFAM134B基因调控猪脂肪沉积的内在机制。实验一金华猪、长白猪背最长肌和皮下脂肪基因表达谱差异研究利用基因芯片技术、生物信息学分析技术研究30和90日龄金华猪与长白猪背最长肌和皮下脂肪的基因表达差异。基因表达谱差异研究结果显示,与长白猪相比,30日龄金华猪背最长肌中显著高表达基因有177个,显著低表达的基因有199个；90日龄显著高表达基因有276个,显著低表达的基因有155个。30日龄金华猪皮下脂肪显著高表达基因有188个,显著低表达的基因有147个；90日龄显著高表达基因有235个,显著低表达的基因有223个。金华猪背最长肌在30和90日龄都显著高表达的基因14个,显著低表达的基因11个；金华猪皮下脂肪在30和90日龄都显著高表达的基因38个,显著低表达的基因18个。进一步通过生物信息学分析可知,金华猪背最长肌、皮下脂肪中显著高表达的差异基因主要为脂肪代谢相关基因和转录因子,表明金华猪脂肪沉积能力明显强于长白猪。实验二猪脂肪沉积关键新功能基因pFAM134B的筛选、克隆及序列分析根据金华猪肌内脂肪含量以及皮下脂肪在90日龄显著增加的趋势,在上述差异表达的基因中,筛选得到一个在90日龄时皮下脂肪以及背最长肌中都显著高表达的基因,其EST序列编号为BF702245。根据已知的EST序列,通过RACE技术,克隆得到其基因全长cDNA序列2889bp,其中包括179bp5’非编码区、978bp编码区和1732bp的3’非编码区,编码区翻译325个氨基酸；BLAST结果表明,该基因编码的氨基酸序列与人、鼠FAM134B基因同源性皆为84%,因此将此基因命名为猪FAM134B基因即为porcine FAM134B （pFAM134B）。实验三pFAM134B基因的组织表达规律及品种差异研究pFAM134B表达的组织特异性研究结果表明,pFAM134B mRNA表达水平在金华猪和长白猪中都是肝脏中最高,其次为皮下脂肪和背最长肌,大脑中表达量最低,肝脏和脂肪组织是脂肪合成的主要场所,pFAM134B在肝脏和皮下脂肪中高表达,说明pFAM134B可能参与脂肪代谢的调控。不同生长阶段表达规律研究结果表明,在肝脏、皮下脂肪和背最长肌中,pFAM134B基因的表达都是随着日龄的增长而升高,在90-120日龄间有略微下降,但在大脑中无明显表达规律。品种差异研究结果表明,在皮下脂肪和背最长肌中,长白猪pFAM134B基因表达量在60日龄前高于金华猪,在90日龄后显著低于金华猪；金华猪大脑中pFAM134B基因表达量高于长白猪,且在90日龄后达到显著水平。以上结果与金华猪肌内脂肪含量以及体脂率的变化规律基本一致,这表明,pFAM134B的表达可能与猪脂肪沉积密切相关。实验四pFAM134B对肌内脂肪沉积的影响及机制研究本试验通过猪肌内前体脂肪细胞的培养,有效结合RNAi技术和基因超表达技术等研究猪新基因pFAM134B调控脂肪沉积的分子机制。首先通过RNAi技术,筛选获得了pFAM134B基因的有效siRNA表达载体fs3,经干扰条件优化以及G418的稳定筛选后干扰效果达到65.0%,转染至肌内前体脂肪细胞后,与对照组相比显著降低了脂肪细胞分化关键基因PPARy以及脂肪合成关键基因FAS和ACC基因的表达（p<0.05）,增强了脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因的表达以及促进脂肪动员的Sirt1基因的表达（p<0.05）,降低了脂肪细胞中甘油三酯的含量,结果表明抑制pFAM134B基因表达后,降低了脂肪细胞分化以及脂肪合成代谢关键功能基因表达,增强了脂肪分解代谢关键功能基因表达,显著降低肌内脂肪的沉积。进一步构建了该基因的超表达载体,实验结果表明,在肌内前体脂肪细胞内超表达pFAM134B基因,显著增加了脂肪合成关键基因FAS和ACC基因以及PPARγ的表达（p<0.05）,降低了脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因以及Sirtl的表达（p<0.05）,增加了肌内脂肪细胞中甘油三酯的沉积（p<0.05）,降低了培养基中游离脂肪酸的含量（p<0.05）,与干扰实验结果相反。上述结果表明,pFAM134B基因可正调控肌内脂肪细胞分化基因以及脂肪合成代谢关键功能基因的表达,可促进肌内脂肪细胞分化,增强脂肪合成速率,进而增强肌内脂肪的沉积。实验五pFAM134B对皮下脂肪沉积的影响及机制研究本试验通过猪皮下前体脂肪细胞的培养,结合RNAi技术和基因超表达技术等研究猪新基因pFAM134B调控皮下脂肪沉积的分子机制。首先通过RNAi技术,筛选获得了pFAM134B基因的有效siRNA表达载体fs3,经干扰条件优化以及G418的稳定筛选后干扰效果达到74.5%,显著升高了脂肪细胞分化基因PPARy以及脂肪分解关键基因ATGL、HSL和促进脂肪动员的Sirt1基因的表达（p<0.05）,降低了脂肪合成关键基因ACC和FAS基因的表达（p<0.05）,显著降低了脂肪细胞中甘油的含量,结果表明抑制（?）pFAM134B基因表达可降低皮下脂肪的沉积。进一步在皮下前体脂肪细胞内超表达该基因,结果表明,皮下脂肪细胞中脂肪合成关键基因FAS和ACC基因表达量显著升高（p<0.05）,脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因的表达显著降低（p<0.05）,但同时也显著降低了PPARy基因的表达,促进了脂肪细胞中甘油三酯的沉积（p<0.05）,降低了培养基中游离脂肪酸的含量（p<0.05）。以上结果表明,pFAM134B基因在皮下脂肪细胞中主要是通过正调控脂肪合成代谢关键功能基因的表达,增强脂肪合成速率来实现脂肪沉积的,细胞分化在此过程中无明显作用,推测皮下脂肪的沉积主要源于脂肪细胞的膨大并非脂肪细胞的分化增殖。综上所述,本研究获得了金华猪和长白猪在30和90日龄背最长肌及皮下脂肪基因转录表达谱,筛选并克隆获得了猪脂肪沉积新功能基因pFAM134B,研究表明,pFAM134B基因可通过正调控脂肪合成代谢关键功能基因的表达,促进脂肪合成的速率,进而提高肌内脂肪和皮下脂肪的沉积,但pFAM134B在肌内脂肪细胞中还能正调控细胞分化基因PPARy,促进肌内脂肪细胞的分化从而增强脂肪沉积,在皮下脂肪细胞中则无此调控功能。这说明肌内脂肪沉积与皮下脂肪沉积有着明显的差异性,推测前者主要靠细胞分化和脂肪合成代谢来调控,后者主要依赖于脂肪合成代谢。