论文摘要
背景：乳腺癌是威胁女性生存的主要肿瘤之一。NGAL为lipocalin蛋白家族的新成员,具有典型的β折叠桶状保守结构,是一种25kD的分泌型糖蛋白。因其结合配体的多样性,NGAL在诸如细胞生长、分化、肿瘤迁移与侵袭以及EMT转变等众多生理与病理学过程中扮演着重要的角色。大量研究结果表明NGAL是一种新的肿瘤标志物,为潜在的肿瘤治疗靶点。NGAL的生物学功能及其表达调控模式因肿瘤种类及其分型而有所不同。研究表明在乳腺癌中NGAL的表达亦与乳腺癌种类及亚型有关,其表达受雌激素受体ER以及转录因子NFAT的调控。在机体内部基因表达调控是一个十分复杂的过程,NGAL在肿瘤细胞内表达的异质性正显示了基因表达调控的复杂性。C/EBPζ为C/EBP家族转录因子成员,对C/EBP家族其他成员的转录调控活性起着负调控的作用。已有研究表明在白血病等肿瘤中C/EBPζ表达明显降低。结合文献以及生物信息学分析我们在NGAL的启动子区发现了潜在的C/EBPζ作用位点,但C/EBPζ是否参与NGAL的表达调控尚不明确。钠氢交换体1（NHE1, Na+/H+exchanger 1）对细胞的pHi起着重要的调节作用,肿瘤细胞内的碱化作用是肿瘤进程中的标志性事件之一。NHE1介导的肿瘤细胞内pHi升高是否对乳腺癌细胞内C/EBPζ以及NGAL的表达具有调控作用仍不明了。目的：以ER受体阴性、具高侵袭能力的乳腺癌MDA-MB-231细胞株为研究对象,分析转录因子C/EBPζ以及NGAL基因在其转移中的生物学作用及其机制。在此基础上阐明NHE1以及C/EBPζ对NGAL基因的调控机制。方法：采用实时定量PCR、western blotting技术检测NGAL在迁移能力不同的细胞系中的差异性表达；通过过表达转录因子C/EBPζ以及基因沉默技术干扰NGAL基因分别研究C/EBPζ以及NGAL在乳腺癌转移中的生物学作用。酶谱法检测过表达C/EBPζ以及干扰NGAL后MMPs蛋白活性的改变。构建NGAL启动子的荧光素酶报告质粒,采用双荧光素酶报告系统研究C/EBPζ以及NHE1对NGAL转录的调控。采用WNT以及NF-KB通路的抑制剂分析了相关信号通路在NGAL介导的肿瘤细胞转移中的生物学作用。结果：相比低迁移能力的ER+的乳腺癌细胞系MCF7,MDA-MB-231细胞系中NGAL基因的表达显著升高,显示了NGAL对转移能力的潜在调控。过表达C/EBPζ以及干扰NGAL基因后MDA-MB-231细胞的转移能力明显受到抑制,细胞的MMPs家族蛋白的表达及其活性均受到影响。双荧光素酶报告实验证实C/EBPζ对NGAL基因启动子的活性有明显的调节作用。采用NHE1的选择性抑制剂Cariporide抑制其活性后,MDA-MB-231细胞的侵袭能力受到明显抑制。双荧光素酶报告实验证实这种抑制作用部分源于C/EBPζ升高所引起NGAL表达降低来完成的。结论：C/EBPζ通过调节NGAL启动子的转录活性来抑制NGAL的表达,进而实现其对MDA-MB-231细胞转移能力的调控。NHE1以及基质金属蛋白酶家族MMPs参与了这一过程的调控。NGAL及其上游相关调控通路是ER-乳腺癌的潜在治疗靶点。背景：多药耐药性（MDR, multidrug resistance）是指对一种药物具有耐药性的同时,对其他结构不同,作用靶点不同的抗肿瘤药物也具有耐药性。对于肿瘤的治疗,目前仍以化疗等常规手段为主,然而化疗除了副作用严重,还有诸如预后效果不佳,疗效差甚至治疗失败等诸多问题。化疗失败主要与肿瘤细胞的多药耐药性有关。药物代谢在机体内部是一个十分复杂的过程,受到一系列不同阶段的分子调控。细胞表面受体（包含调节药物向胞外外排泵,胞内运送通道以及核内受体等）、药物代谢酶等诸多环节都参与了药代动力学的调控。NGAL是一种新近发现的肿瘤标志分子,其表达与药物刺激等因素有关；上调NGAL的表达有利某些药物的作用,促进肿瘤细胞的凋亡；NGAL具有结合多种潜在配体的能力,显示了NGAL在药物转运方面的潜在功能。目的：本研究以Rh123染料荧光为指示,阐明NGAL对小分子化合物转运的调控作用及其相关的信号机制。方法：采用激光共聚焦与流式细胞仪检测NGAL干扰,MAPKs以及NHE1的选择性抑制剂处理后,细胞内部Rh123荧光在细胞内的累积程度；采用实时定量PCR以及免疫印迹检测NGAL干扰,MAPKs以及NHE1的选择性抑制剂处理后,细胞内部NGAL的表达情况；采用免疫印迹法观察MAPKs以及NHE1的选择性抑制剂处理后内MAPKs磷酸化水平的改变；采用免疫印迹法观察NGAL干扰后对细胞周期蛋白表达的影响；采用集落形成实验以及MTT法检测NGAL干扰后细胞增殖能力的改变。结果：实时定量以及免疫印迹实验表明NGAL干扰后,细胞内部的NGAL表达明显下降,伴随NGAL的下降,细胞内的Rh123的荧光强度降低。MAPKs抑制剂处理细胞后,细胞内的MAPKs家族蛋白磷酸化水平受到抑制,NGAL的表达受到明显影响,细胞内部的Rh123荧光强度降低,表明Rh123在胞内的累积受到MAPKs信号通路的影响。NHE1调控着MAPKs磷酸化以及NGAL的表达,进而影响Rh123在胞内的累积,但NHE1对Rh123在胞内的累积影响能力有限且有细胞的种类的依赖性。NGAL干扰能够引起MDA-MB-231细胞EMT的转变,以及K562细胞增殖能力的变化,这些过程是否参与Rh123的转运调控仍需进一步的研究。结论：NGAL调控Rh123在细胞内的转运,这一过程受到MAPKs家族磷酸化以及NHE1的调节。背景：Calcineurin B homologous protein （CHP） 2是NHE1的结合蛋白及其活性的亚调节单位。CHP2仅在肿瘤组织中高表达,是维持肿瘤细胞血清饥饿条件下NHE1异常激活状态的重要因素之一。CHP2与肿瘤迁移、侵袭等诸多生物学功能相关,这些过程都与肿瘤细胞内NHE1的异常激活紧密的联系在一起。CHP1是CHPs家族的另一成员,表达在正常的细胞中,为调节NHE1活性所必须的亚单位。研究发现CHP1的关键氨基酸序列与模体结构为NHE1活性调节所必须。但有关CHP2如何发挥其对NHE1的调节作用以及CHP2与NHE1这两个蛋白的结合的机制尚不明确。CHP2如何定位于细胞膜表面的也没有相关的报道。另外在CHP2氨基酸序列中我们发现一个潜在的核输出多肽NES （nucler export signal）序列。在CHP1中,NES序列调控着其在细胞核内外的定位。有文献报道CHP2蛋白在核内的分布强于胞质,这说明CHP2蛋白定位于细胞核内并起着某种生物学功能的调节作用。但CHP2的核内定位是否受到这一潜在的NES序列调节还不是十分清楚。本研究期望通过相关的实验明确CHP2在细胞不同亚细胞定位的分子机制,阐明CHP2对NHE1的结合的关键氨基酸序列,最后验证CHP2定位在细胞核内部的生物学功能和意义,明确CHP2对肿瘤细胞生物学功能的调控。目的：鉴定CHP2氨基酸序列中与NHE1相结合的关键序列,明确CHP2不同亚细胞定位的机制及其核内定位的生物学功能。方法：采用生物信息学手段分析CHP2氨基酸序列中存在的与NHE1结合以及与蛋白核定位有关的潜在信号；采用基于PCR扩增的方式构建CHP2的EF手相以及NES突变体；构建GFP绿色荧光蛋白标记的CHP2野生型以及突变型的重组质粒,荧光共聚焦显微镜观察CHP2蛋白在细胞内的亚定位；采用膜截留法测定CHP2及其突变体的Ca2+平衡以及解离曲线；免疫共沉淀检测Ca2+对CHP2与NHE1结合的影响；采用MTT法以及软琼脂集落形成实验检测NES突变后CHP2对HeLa细胞的增殖能力的影响；动物体内实验检测CHP2的NES突变体对其致瘤能力影响。结果：CHP2氨基酸序列中存在着两个功能性的EF手相以及NES核输出信号多肽序列；突变EF3&4两个EF手相将影响CHP2蛋白构象,以及CHP2与Ca2+的结合能力,改变CHP2的Ca2+平衡与解离曲线；Ca2+的存在影响着CHP2以及NHE1的结合。突变NES序列后,CHP2蛋白定位在细胞核内,细胞的增殖以及致瘤能力显著增强。结论：CHP2氨基酸序列中存在着两个功能性的EF手相结构,EF手相的Ca2+结合状态,NHE1以及CHP2三者的结合决定着CHP2蛋白在细胞膜上的定位,从而使得CHP2发挥其NHE1活性调节的作用；CHP2蛋白内存在着一个功能性的NES序列,决定着CHP2在核内外的亚定位,CHP2定位于核内将显著地促进HeLa细胞的增殖和成瘤能力。CHP2蛋白不同亚细胞定位对HeLa细胞增殖调控具有差异性。
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相关论文文献
- [1].肿瘤相关基因chp2在白血病细胞中表达的研究[J]. 中国实验血液学杂志 2008(04)
- [2].肿瘤相关抗原CHP2促进HEK293细胞在裸鼠腹腔内的转移[J]. 北京大学学报(医学版) 2009(05)
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