猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其核酸疫苗的初步研究

论文摘要

本研究从四川某猪场疑似胸膜肺炎放线杆菌感染的病料中分离到一株革兰氏阴性小球杆菌。经染色镜检、生化试验、PCR检测、血清型检测和药敏试验,鉴定该菌为猪胸膜肺炎放线杆菌1型。该菌的生长对营养条件的要求特别高,在普通营养琼脂平板中不生长,对NAD具有依赖性,在TSA平板（含NAD）中生长出表面光滑、湿润、半透明、边缘整齐,中间略隆起的针尖至中等大小的菌落,菌落随着培养次数的增加会略有变大。CAMP试验阳性,微量生化管进行生化试验得到该菌基本符合APP生化特征,能够发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、果糖、尿素、ONPG,甘露醇和硝酸盐还原酶。药敏试验结果表明该菌对青霉素类和喹诺酮类药物敏感,而对生产上常用的头孢类抗生素中度敏感,对四环素、氯霉素、甲氧苄啶以及氨基糖苷类的一些药物有耐药性。采用PCR技术分别扩增血清1型APP的Apx I A的N端基因片段和OmlA基因,并先将其分别定向克隆到pMD18-T Simple载体上。再将Apx I A的N端基因片段定向插入真核表达载体pIRES中,得到重组质粒pIRES-Apx I A;然后将另一目的基因OmlA定向插入到重组质粒pIRES-Apx I A中,得到一个新的重组质粒pIRES-Apx I A-OmlA.采用Xfect转染试剂盒将pIRES-Apx I A-OmlA DNA转染哺乳动物细胞BHK-21细胞,间接免疫荧光法观察到绿色荧光,SDS-PAGE检测得到转染后细胞中表达出两段蛋白条带,且这两段蛋白的大小分别与两个目的蛋白的大小一致。说明成功构建出真核共表达的重组质粒pIRES-Apx I A-OmlA,其能够在哺乳动物细胞内进行体外表达。将重组质粒pIRES-Apx I A-OmlA DNA （A组）、pIRES-Apx I A DNA （B组）,空载体pIRES DNA （C组）,血清1型APP的灭活苗（D组）以及生理盐水（E组）分别免疫Balb/c鼠,免疫3次,每次间隔两周。通过检测小鼠血清中IgG2a /IgG1、IL-4、IFN-y的含量变化,脾淋巴细胞增值反应及T淋巴细胞亚群的百分含量比较了各免疫组的免疫原性。结果显示A、B、D组免疫小鼠血清中的IgG1、IgG2a. IL-4、IFN-y含量均有上升,且与对照组C组和E组有显著性的差异（P<0.01）,且A组极显著高于B组（P<0.01）；三免后D组的IgG1、IL-4含量上升显著,而IgG2a. IFN-y含量却有所降低；各组小鼠血清抗体亚类IgG2a/ IgGl值得到阳性重组质粒组A、B组以产生IgG2a抗体为主,而灭活疫苗组则以产生IgG1抗体为主。三免后,A、B、D组对脾淋巴细胞都有比较强的诱导增值作用,A组极显著高于B、D组（P<0.01）,B组显著高于D组（0.01<P<0.05）。A、B组的CD3+、CD4+、CD8+百分含量在三免后都极显著高于C组和E组（P<0.01）；D组的CD3+、CD4+百分含量极显著高于C组和E组（P<0.01）,而极显著低于A组和B组（P<0.01）,CD8+百分含量显著低于A、B两组（0.01<P<0.05）,而略高于对照组C组和E组（P<0.01）；A组和B组之间CD3+含量有显著性差异（0.01<P<0.05）,CD4+含量有极显著差异（P<0.01）,CD8+含量无显著性差异（P>0.05）。提示构建的pIRES-Apx I A-OmlA重组质粒能够刺激和诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫反应,双基因共表达的核酸疫苗较单基因表达的核酸疫苗免疫效果明显,这为APP核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。同时也证实了核酸疫苗能同时刺激动物机体的体液免疫和细胞免疫,并且以Thl型的细胞免疫应答为主,而灭活疫苗则主要是产生以Th2型免疫应答为主的体液免疫。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎的病原学特性
• 1.1.1 病原形态
• 1.1.2 生长特性
• 1.1.3 生化特性
• 1.1.4 生物型与血清型
• 1.1.5 毒力因子及致病性
• 1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学
• 1.3 猪传染性胸膜肺炎的诊断
• 1.3.1 临床诊断和病理变化
• 1.3.2 病原学诊断
• 1.3.3 血清学方法诊断
• 1.3.4 分子生物学方法诊断
• 1.4 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展
• 1.4.1 传统的灭活疫苗
• 1.4.2 弱毒疫苗
• 1.4.3 亚单位疫苗
• 1.4.4 基因疫苗
• 1.4.5 口服疫苗
• 1.5 本研究的目的、意义
• 2 材料
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病料来源
• 2.1.2 细胞、菌株、载体及实验动物
• 2.1.3 主要培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 主要溶液配制
• 2.3.1 细菌培养用液
• 2.3.2 细胞培养用液
• 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 2.3.4 SDS-PAGE所用试剂
• 3 实验方法
• 3.1 APP的分离鉴定
• 3.1.1 细菌的分离
• 3.1.2 微生物学鉴定
• 3.1.3 PCR鉴定
• 3.1.4 血清型鉴定
• 3.2 1型APP核酸疫苗的初步研究
• 3.2.1 APP基因组DNA的提取
• 3.2.2 引物的设计与合成
• 3.2.3 目的基因的PCR扩增
• 3.2.4 Apx Ⅰ A基因片段和OmIA基因的克隆
• 3.2.5 pIRES-Apx Ⅰ A-OmIA真核表达质粒的构建
• 3.2.6 重组质粒pIRES-Apx Ⅰ A-OmIA的体外表达
• 3.2.7 重组质粒免疫原性的初步研究
• 4 结果
• 4.1 细菌的分离鉴定
• 4.1.1 细菌的形态
• 4.1.2 生化试验结果
• 4.1.3 药敏试验结果
• 4.1.4 血清型鉴定
• 4.1.5 PCR鉴定
• 4.2 重组表达载体的构建
• 4.2.1 Apx Ⅰ A N端基因片段的扩增
• 4.2.2 OmlA基因的扩增
• 4.2.3 pMD-Apx Ⅰ A重组质粒的构建
• 4.2.4 pMD-OmlA重组质粒的构建
• 4.2.5 pIRES-Apx Ⅰ A重组质粒的构建
• 4.2.6 pIRES-Apx Ⅰ A-OmlA真核表达载体的构建
• 4.3 真核表达载体pIRES-Apx Ⅰ A-OmlA的体外表达
• 4.3.1 pIRES-Apx Ⅰ A-OmlA转染BHK-21细胞
• 4.3.2 体外表达产物的SDS-PAGE检测
• 4.4 重组质粒pIRES-Apx Ⅰ A-OmlA对小鼠的免疫原性
• 1、lgG_2a抗体的检测结果'>4.4.1 免疫小鼠血清中IgG₁、lgG_2a抗体的检测结果
• 4.4.2 免疫小鼠血清中IL-4、IFN-γ含量的检测结果
• 4.4.3 免疫小鼠T淋巴细胞亚群的检测结果
• 4.4.4 免疫小鼠脾淋巴细胞增值试验结果
• 5 讨论
• 5.1 APP的分离与鉴定
• 5.2 目的基因的选择
• 5.3 真核表达载体的选择与构建
• 5.4 重组质粒的体外表达
• 5.5 核酸疫苗对小鼠的免疫原性
• 5.5.1 体液免疫
• 5.5.2 细胞免疫
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢