论文摘要
目的:肝脏具有很强的再生能力,是肝脏对于切除或毒性损害后的一种代偿反应。大鼠肝切除70%后,残余肝脏再生过程于肝部分切除后数小时内启动并于7～10天后结束。再生肝脏有一重要的生理特征,即具有很强的抗损伤能力。已知再生肝对于四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）等肝毒剂有一定的抗损伤能力,但不同时间点的再生肝,其抗损伤能力还不十分清楚,如果能动态观察不同时间点再生肝抗损伤及其相关生理、生化指标的变化,将使我们进一步了解再生肝抗损伤的机制。对于抗损伤机制的研究,不仅可以深入认识肝脏生理活动的规律,揭示肝再生的调控机制,也将为临床肝病、部分切除甚至移植等肝损伤与再生的应用提供重要的实验依据。本实验的目的是观察不同时间点的再生肝抗四氯化碳损伤能力的变化。解偶联蛋白2（uncoupling protein 2, UCP2）是晚近发现的线粒体内膜解偶联蛋白家族成员,广泛分布于啮齿类动物的多种组织。目前,UCP2的生理功能尚不十分清楚。实验证据表明,UCP2可以降低ROS产生,在细胞受到氧化损伤时起保护作用。CCl4是常用的肝毒剂,在肝细胞微粒体经P-450酶代谢,引起肝细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生增加。大量ROS介导细胞氧化损伤,参与许多肝毒剂的肝损害过程,因此肝细胞内自由基的产生和清除成为肝脏抗损伤的关键问题。因此我们推测UCP2可能通过其降低ROS的功能参与再生肝的抗损伤机制。另外,UCP2作为线粒体内膜上的离子通道,可引发质子从线粒体膜间腔回流至基质（质子漏）,降低线粒体内膜质子跨膜梯度,导致氧化磷酸化解偶联。如此以来UCP2的表达可能降低细胞内的能量储备,使细胞更易受到毒物损伤。本研究通过实验,观察了UCP2在ROS和ATP之间的调节功能及其对细胞的影响,并探讨了UCP2在肝再生不同时间点抗损伤中的作用。方法:健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组:正常组（control）,假手术损伤组（SO/CCl4）,肝切组（PH）和肝切损伤组（PH/CCl4）,正常组5只大鼠,其余3组,每组20只,分别于术后24h、48h、72h、96h进行实验。乙醚麻醉下进行手术,肝切手术按文献方法切除2/3肝组织。假手术损伤组大鼠除不实施肝切外,其余操作与肝切组相同。本研究选用CCl4做肝毒剂。手术后对假手术损伤组和肝切损伤组分别在术后24h、48h、72h、96h,按5ml/kg体重给予50%CCl4（CCl4:豆油=1:1）灌胃,肝切组按同样剂量和方式只给豆油。给药24h后将大鼠断头处死,取血检测血清谷丙转氨酶（alanine amiotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）水平;取肝组织制匀浆检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）的含量。另取肝组织制备线粒体,检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）。制作肝组织石蜡切片,HE染色观察肝形态学改变,免疫组织化学染色观察肝组织中UCP2和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的表达。Western blot方法检测肝线粒体内UCP2表达并进行定量分析。结果:1.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝组织形态的改变HE染色结果显示,正常组肝细胞形态正常,中央静脉周围肝细胞索排列紧密;假手术损伤组大鼠肝细胞索状排列紊乱,炎性和坏死细胞增多,出现脂肪样变。肝切24h损伤组肝组织中有广泛、大量的肝细胞气球、脂肪样变,有出血及炎细胞浸润,部分细胞坏死,肝小叶结构严重破坏,条索状排列消失;随着肝切除后肝脏的再生,肝组织中脂肪样变、坏死、出血及炎细胞浸润逐渐减少,肝小叶结构逐渐恢复,条索状排列出现;至肝切96h损伤组时再生肝细胞肝小叶结构破坏较轻,条索排列保留,只有轻度的脂肪变性,局部区域有炎细胞浸润,无肝细胞坏死。2.肝再生不同时间点CCl4损伤后血清中ALT、AST含量的变化CCl4损伤后肝细胞内ALT、AST释放入血,肝切损伤组血清ALT、AST水平在24h时均显著上升,约为假手术损伤组的3倍（P<0.001）。随着肝的再生,血清ALT、AST水平逐渐下降,至96h时ALT、AST水平明显低于假手术损伤组（P<0.001）,也明显低于24h的ALT、AST水平（P<0.001）。3.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝组织中MDA含量的变化CCl4损伤后再生肝组织内的MDA含量在24h时升高,明显高于假手术损伤组（P<0.001）;随着肝再生时间的延长肝组织中MDA含量逐渐降低,至96h时肝组织中MDA含量低于假手术损伤组（P<0.01）和24h（P<0.001）。4.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝组织内ATP水平的改变CCl4损伤后肝组织中ATP含量在24h时明显降低,与假手术损伤组相比有显著性差异（P<0.001）,随着肝脏不断的再生,ATP水平逐渐升高,至96h时明显高于假手术损伤组（P<0.001）和24h组（P<0.001）。5.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝细胞线粒体膜电位的变化CCl4损伤后肝细胞线粒体膜电位在24h时明显高于假手术损伤组（P<0.01）;96h时的线粒体膜电位与假手术损伤组相比明显升高（P<0.001）,也高于24h（P<0.01）。6.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝组织UCP2的表达免疫组织化学结果显示,正常组肝实质细胞内不表达UCP2。在假手术损伤组和肝切损伤组中,肝实质细胞内均有棕黄色阳性颗粒分布。肝切24h损伤组UCP2表达最丰富,肝实质细胞胞浆内几乎充满阳性颗粒;肝切96h损伤组UCP2表达也较丰富。Western blot实验定量分析表明, CCl4损伤后肝组织中的UCP2表达在24h和96h时均明显高于假手术损伤组（P<0.001）,但96h时UCP2表达明显低于24h的UCP2表达（P<0.001）。7.肝再生不同时间点CCl4损伤后肝组织PCNA的表达免疫组织化学结果显示,正常情况下仅见少数PCNA阳性肝细胞,表达也较弱。假手术损伤组PCNA阳性细胞明显增多;肝切除后肝再生过程中,肝切24h损伤组PCNA阳性肝细胞数量多,表达也较强,术后48h达到高峰,以后PCNA表达迅速减弱,至96h时PCNA表达与正常组相近。结论:1. CCl4可通过ROS水平的升高引起肝细胞的损伤。2.肝切后24h,再生肝抗损伤能力较差;随着肝脏不断的再生,抗损伤能力逐渐增强,至96h时其抗损伤能力较强。3.肝切后24h再生肝ATP含量较低,随着肝脏的再生,ATP含量升高。ATP可能在再生肝抗CCl4损伤中具有重要的作用。4. UCP2在再生肝及再生肝损伤后表达增加,表明UCP2表达与肝细胞增殖和再生肝抗损伤密切相关。