枯草芽胞杆菌TR21对香蕉枯萎病生防机制研究

论文摘要

为了加快对香蕉枯萎病的防控菌株及机理的研究,本文对该病具有初步防治效果的芽胞杆菌菌株TR21开展了鉴定、生物学特性、产酶能力、抗菌作用及其成分等研究,在温室测定了菌株TR21对香蕉枯萎病的防治效果、在香蕉体内和根际的定殖情况、对香蕉抗病相关酶活性的影响以及抗病相关基因表达的影响,为该生防菌株的进一步研究和应用奠定了基础。其结果如下：1、利用API 50 CH系统对菌株TR21的鉴定显示其与枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）的相似性为90.3%；通过结合16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列的系统发育分析结果也鉴定该菌为枯草芽胞杆菌。2、菌株TR21生长的pH值范围为5.0-9.0,最适pH值为6.0,在所测定的碳、氮源中,葡萄糖和酵母提取物分别为最佳营养。NB培养基测定的生长曲线显示14h内该菌株生长达到稳定期。该菌株在NB培养基中产胞外蛋白酶而不产几丁质酶,在香蕉组织浸提液培养基中既不产蛋白酶又不产几丁质酶。抗菌谱研究显示该菌株在平板上对包括多株香蕉枯萎病菌在内的多种植物病原真菌具有广谱抗性。菌株TR21胞外物质抑菌试验结果表明,蛋白和脂肽粗提物均对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性。3、在温室利用伤根和叶腋接种TR21发酵液开展了香蕉枯萎病盆栽防效测定,在接种香蕉枯萎病病原菌后40 d的防治效果分别为（81.10±2.80）%和（79.32±4.49）%。采用伤根和灌根法接种,标记菌株在香蕉体内及根际的定殖动态总体呈下降趋势。采用叶腋法接种,标记菌株仅能在叶片中定殖,其定殖动态表现为“由升到降”趋势。因此,3种方式接种后菌株TR21均能够在香蕉体内定殖和传导,且在香蕉根表和根际土壤中有较好的定殖能力。推测诱导系统抗性可能是叶腋接种菌株TR21防治香蕉枯萎病的主要机制。4、比较了TR21发酵液、菌体、上清和NB培养基分别处理香蕉后,香蕉根系内PPO、POD和PAL活性的变化,发现以上处理均比无菌水对照高,但接种TR21发酵液、菌体的3种酶活性均明显高于接种上清和NB的处理。可以判断TR21发酵液中主要有效诱导组分为菌体。灌根接种TR21菌体可以引起香蕉叶片中PPO、POD和PAL活性升高,推测诱导系统抗性可能是菌株TR21防治香蕉枯萎病的机制之一。5、利用半定量RT-PCR法,研究了接种菌株TR21后对香蕉根系4种抗病相关基因表达的影响。结果表明,PAL、POD.PR-3、PR-1、基因在接种后均表达上调,但PAL、POD基因的表达增幅明显高于PR-3、PR-1基因。PAL、POD基因均在接种后12h表达量最高,与其根部定殖规律类似。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物病害生防芽胞杆菌的研究进展
• 1.1.1 生物防治的重要性
• 1.1.2 芽胞杆菌的生防应用状况
• 1.1.3 芽胞杆菌的生防机理研究现状
• 1.1.3.1 芽胞杆菌对植物的促生作用
• 1.1.3.2 芽胞杆菌与病原生物竞争营养和生态位点
• 1.1.3.3 芽胞杆菌对植物诱导抗性作用
• 1.1.3.4 芽胞杆菌对病原生物的拮抗作用
• 1.2 香蕉枯萎病的发生、防治及抗病性研究概况
• 1.2.1 香蕉枯萎病的发生
• 1.2.2 香蕉枯萎病的防治
• 1.2.2.1 抗病品种选育
• 1.2.2.2 生物防治
• 1.2.3 香蕉抗枯萎病机理研究
• 1.2.3.1 香蕉品种抗性机理研究
• 1.2.3.2 生防菌诱导香蕉产生系统抗性的研究
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 菌株TR21的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 主要试剂和仪器
• 2.1.3 菌株TR21的生化鉴定
• 2.1.4 菌株TR21的分子鉴定
• 2.1.4.1 基因组DNA的提取
• 2.1.4.2 16S rDNA序列的PCR扩增和序列测定
• 2.1.4.3 gyrA、gyrB基因序列的PCR扩增和序列测定
• 2.1.4.4 系统发育分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌株TR21的生化鉴定
• 2.2.2 菌株TR21的分了鉴定
• 2.2.2.1 菌株TR21的16S rDNA、gyrA和gyrB基因序列测定
• 2.2.2.2 基于16S rDNA序列的系统发育分析
• 2.2.2.3 基于gyrA和gyrB基因的系统发育分析
• 2.2.3 不同鉴定方法评价
• 2.3 讨论
• 3 菌株TR21生物学特性、产酶能力、抗菌作用及其成分分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 菌株TR21生物学特性测定
• 3.1.3.1 pH值对菌株TR21生长的影响
• 3.1.3.2 菌株TR21对碳源的利用
• 3.1.3.3 菌株TR21对氮源的利用
• 3.1.3.4 菌株TR21生长曲线的测定
• 3.1.4 菌株TR21的产酶能力测定
• 3.1.5 菌株TR21的抗菌谱测定
• 3.1.6 菌株TR21胞外蛋白与脂肽粗提物的制备
• 3.1.7 粗提物对香蕉枯萎病菌抑制作用的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 菌株TR21生物学特性
• 3.2.1.1 不同pH值对TR21生长的影响
• 3.2.1.2 不同碳源对菌株TR21生长的影响
• 3.2.1.3 不同氮源对菌株TR21生长的影响
• 3.2.1.4 菌株TR21的生长曲线
• 3.2.2 菌株TR21的产酶能力
• 3.2.3 菌株TR21对不同植物病原真菌的抑制作用
• 3.2.4 粗提物对香蕉枯萎病菌的抑制作用
• 3.3 讨论
• 4 菌株TR21对香蕉枯萎病的防治效果及定殖能力研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试菌株及试剂
• 4.1.2 菌株TR21对香蕉枯萎病的温室盆栽防治试验
• 4.1.2.1 接种
• 4.1.2.2 病情统计
• 4.1.3 菌株TR21抗链霉素标记
• 4.1.4 标记菌株稳定性试验
• 4.1.5 标记菌株对香蕉枯萎病菌的拮抗作用
• 4.1.6 标记菌株在香蕉体内及根际的定殖测定
• 4.1.6.1 接种方法
• 4.1.6.2 标记菌株在香蕉体内的定殖与消长动态
• 4.1.6.3 标记菌株在香蕉根际土壤中的定殖与消长动态
• 4.1.6.4 标记菌株在香蕉根表的定殖与消长动态
• 4.1.7 数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌株TR21对香蕉枯萎病的防治效果
• 4.2.2 菌株TR21天然抗药性
• 4.2.3 抗链霉素标记菌的筛选及其稳定性和拮抗活性测定
• 4.2.4 标记菌株在香蕉体内、根表和根际土壤中的定殖与消长动态
• 4.2.4.1 标记菌株在香蕉体内的定殖与消长动态
• 4.2.4.2 标记菌株在香蕉根际土壤中的定殖与消长动态
• 4.2.4.3 标记菌株在香蕉根表的定殖与消长动态
• 4.3 讨论
• 5 菌株TR21对香蕉抗病相关酶活的诱导作用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.2.1 菌株的制备及接种
• 5.1.2.2 粗酶液的制备
• 5.1.2.3 抗病相关酶活性的测定
• 5.1.2.4 统计分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 TR21发酵液不同组分对香蕉根系内抗病相关酶活的影响
• 5.2.1.1 多酚氧化酶（PPO）活性测定
• 5.2.1.2 过氧化物酶（POD）活性测定
• 5.2.1.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定
• 5.2.2 TR21菌体对香蕉叶片中抗病相关酶活的影响
• 5.3 讨论
• 6 菌株TR21对香蕉抗病相关基因的诱导作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 供试菌株和植株
• 6.1.1.2 主要仪器及试剂
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 菌株的制备及接种
• 6.1.2.2 总RNA的提取、定量与完整性检测
• 6.1.2.3 cDNA第1链的合成
• 6.1.2.4 引物设计及合成
• 6.1.2.5 PCR反应
• 6.1.2.6 抗病相关基因和内标基因PCR循环数的确定
• 6.1.2.7 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测分析
• 6.1.2.8 数据分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 总RNA的提取
• 6.2.2 PCR扩增结果
• 6.2.3 半定量RT-PCR循环数的确定
• 6.2.4 香蕉根系抗病相关基因的半定量RT-PCR结果
• 6.2.4.1 接种菌株TR21后香蕉根系PAL基因的表达
• 6.2.4.2 接种菌株TR21后香蕉根系POD基因的表达
• 6.2.4.3 接种菌株TR21后香蕉根系PR-3基因的表达
• 6.2.4.4 接种菌株TR21后香蕉根系PR-1基因的表达
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况