刺糖多孢菌对剪切力抗性的初步研究

论文摘要

通过对刺糖多孢菌（Saccharopolyspora Spinosa）G9菌株进行单孢分离、复壮,获得一株较高产的菌株G9-21,以G9-21为出发菌株进行紫外诱变,获得比G9-21效价（154μg／mL）提高了15.7%的菌株UV67；再对UV67进行链霉素抗性育种筛选,获得具有链霉素抗性菌株S26,其效价（189gg／mL）比UV67效价（155μg／mL）提高了21.9%；以G9-21（Spc+　Str-）和S26（Spc-Str+）两个菌株为两亲本,进行基因组重排育种,经过6轮融合,初筛和复筛,得到比S26效价（189gg／mL）提高了94.7%的菌株R61（368gg／mL）；最后以菌株R61为出发菌株,进行杆菌肽抗性育种筛选,得到一株具有杆菌肽抗性、发酵效价提高了7.3%的菌株B13（395 gg／mL）。通过以上多种育种方法,出发菌株发酵效价提高了156.5%。以G9-21 （Spc+ Str-）和S26 （Spc-Str+）两个菌株为两亲本,进行基因组重排育种,经过8轮连续融合,计算融合率,发现融合到第6轮后,融合率不再发生变化,即刺糖多孢菌有效融合轮数为6轮。以刺糖多孢菌G9-21 （Spc+ Str-）和阿维链霉菌Z1-106 （Spc- Str+）为两亲本,进行了属间融合的尝试,以期能改善刺糖多孢菌对剪切力敏感的问题。将直径约为3mm、、大小均匀、千粒重为267g的玻璃珠添加在摇瓶中,以此模拟工业发酵的剪切力,从加入玻璃珠数量、不同时间加入玻璃珠和不同时间取出玻璃珠三个方面对剪切力与刺糖多孢菌产素能力的关系进行了初步探索,在菌体对数生长期时加入剪切力对菌体损伤最大,并导致菌体产素能力降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 多杀菌素的由来
• 1.2 多杀菌素的研究进展
• 1.2.1 多杀菌素的产生菌
• 1.2.2 多杀菌素的化学结构
• 1.2.3 多杀菌素的理化性质
• 1.2.4 多杀菌素的生物合成
• 1.2.4.1 多杀菌素生物合成基因簇及其功能
• 1.2.4.2 多杀菌素生物合成途径
• 1.2.5 多杀菌素的生物活性
• 1.2.5.1 多杀菌素的杀虫机制
• 1.2.5.2 多杀菌素的杀虫活性及安全性
• 1.2.6 多杀菌素产生菌育种
• 1.2.6.1 诱变育种
• 1.2.6.2 基因组重排育种
• 1.3 机械剪切力对刺糖多孢菌的影响
• 1.4 本试验研究的思路及目标
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.2.1 斜面培养基
• 2.1.2.2 种子培养基
• 2.1.2.3 发酵培养基
• 2.1.2.4 P培养液
• 2.1.2.5 原生质体制备培养基
• 2.1.2.6 原生质体再生培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2. 试验方法
• 2.2.1 效价分析方法
• 2.2.1.1 初筛
• 2.2.1.2 复筛
• 2.2.2 诱变处理方法
• 2.2.2.1 紫外诱变
• 2.2.2.2 链霉素诱变
• 2.2.2.2.1 抗生素平板的制作
• 2.2.2.2.2 最小抑制浓度
• 2.2.2.2.3 诱变处理
• 2.2.3 原生质体制备、再生及融合
• 2.2.3.1 刺糖多孢菌原生质体制备方法
• 2.2.3.2 阿维链霉菌原生质体制备方法
• 2.2.3.3 原生质体再生率计算方法
• 2.2.3.4 再生培养基的选择
• 2.2.3.5 原生质体融合方法
• 2.2.3.6 融合率计算方法
• 2.2.4 基因组重排方法
• 2.2.4.1 第一轮融合
• 2.2.4.2 杂合子原生质体制备及多轮融合
• 2.2.5 模拟剪切力试验
• 2.2.5.1 不同大小的剪切力
• 2.2.5.2 不同时间加入剪切力
• 2.2.5.3 不同时间去除剪切力
• 3 结果与分析
• 3.1 刺糖多孢菌G9-21与阿维链霉菌Z1-106融合
• 3.1.1 出发菌株的选择
• 3.1.2 抗性测定
• 3.1.3 再生培养基的选择
• 3.1.4 不同PEG分子量对融合率的影响
• 3.1.5 不同PEG浓度对融合率的影响
• 3.1.6 刺糖多孢菌与阿维链霉菌融合小结
• 3.2 刺糖多孢菌G9-21和S26融合
• 3.2.1 紫外诱变
• 3.2.2 链霉素诱变
• 3.2.2.1 最小抑制浓度确定
• 3.2.2.2 链霉素抗性育种结果
• 3.2.3 多轮融合
• 3.2.4 融合子高产菌株筛选
• 3.2.5 杆菌肽诱变结果
• 3.3 菌株对抗生素耐受水平与抗剪切力的关系
• 3.3.1 抗青霉素水平与抗剪切力的关系
• 3.3.2 抗杆菌肽水平与抗剪切力的关系
• 3.4 模拟剪切力试验结果
• 3.4.1 加入玻璃珠数量
• 3.4.2 不同时间加入玻璃珠
• 3.4.3 不同时间取出玻璃珠
• 3.4.4 剪切力对菌丝生长的影响
• 3.4.5 模拟剪切力试验小结
• 4 分析与讨论
• 4.1 育种方法
• 4.2 属间融合的问题
• 4.3 刺糖多孢菌基因组重排有效轮数
• 4.4 菌株抗素水平对剪切力耐受度的影响
• 4.5 剪切力在不同发酵时期的影响
• 参考文献
• 致谢