庆大霉素生物合成中关键酶性质与调节的研究

论文摘要

小单孢菌（Micromonospora purpurea）生产庆大霉素产量一直不高，本室发明了一种“低成本、高效率生产庆大霉素”的新方法（国家发明专利），在培养基中添加几种氨基酸，发酵周期由原120140h左右缩短到7080h，产素率提高80%90%，但氨基酸的作用机理尚不清楚，故本文从微生物代谢调控出发，围绕氨基酸对糖酵解途径中关键酶和细胞膜的作用机理进行了探索。首先建立了反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定己糖激酶（HK）活性的新方法，本方法未见报道。通过检测HK催化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸反应中ADP的生成量来确定HK的活性。实验所用ADP在0.010.40mmol/L范围内与ADP峰面积具有良好的线性关系，相关系数为0.999，当信噪比（S/N）为3时，ADP最低检测浓度为0.7μg/mL。本实验确定了酶促反应最适温度为30℃，最适pH为7.0，反应时间为30min。与酶偶联法测HK活性相比，本方法精密度好，相对成本低，能准确测定HK的活性。研究了氨基酸对绛红色小单孢菌HK活性的影响。用对数生长期的菌体细胞制备HK粗酶液，超声波破碎条件为350W，工作2S，间歇3S，时间35min。用新建立的RP-HPLC检测HK活性，酶促反应最适温度30℃、pH为7.0。HK的加标回收率为95.3%97.6%。研究中还探索了氨基酸对HK活性的影响，结果表明单独添加Lys、Arg、Met可使HK比活力分别增强13.1%、6.8%、9.6%。正交设计三种氨基酸对HK酶活性的影响程度是Lys>Met>Arg，HK活性提高幅度最大的添加浓度为Lys0.02%，Arg0.0001%，Met0.03%，比活力较对照提高17.1%。还研究了氨基酸对绛红色小单孢菌磷酸果糖激酶（PFK）活性的影响。从对数期细胞中制备PFK粗酶液，细胞破碎条件同HK。PFK粗酶液酶促反应最适温度为30℃、pH为7.5。PFK的加标回收率为89.5%93.1%。在PFK粗酶液中单独添加Lys、Arg、Met可分别提高PFK比活力10.4%、6.5%、9.38%；正交设计三种氨基酸对PFK酶活性的影响程度为Lys>Met>Arg，PFK比活力增加最大的添加浓度为Lys0.02%，Arg0.001%，Met0.03%，较对照提高14.4%。考察了Lys、Arg、Met对绛红色小单孢菌细胞膜的作用，结果表明：新方法庆大霉素分泌率较原工艺高，特别发酵84h时提高最为显著（38.3%/27.3%）为40.3%；添加青霉素后新方法庆大霉素分泌率也较原工艺高，发酵84h时（55.6%/41.6%）提高约为33.7%。从而在一定程度上解释了新方法添加氨基酸可提高庆大霉素产素率的机理。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 小单孢菌产庆大霉素的研究与现状
• 1.2.1 小单孢菌简介
• 1.2.2 庆大霉素简介
• 1.2.3 庆大霉素的研究现状
• 1.2.4 庆大霉素的生物合成途径
• 1.2.5 庆大霉素的产生与代谢调节的关系
• 1.3 糖酵解途径中关键酶的研究与现状
• 1.3.1 己糖激酶（HK）研究与现状
• 1.3.1.1 己糖激酶（HK）的研究进展
• 1.3.1.2 HK 的催化过程
• 1.3.1.3 HK 活性的测定方法
• 1.3.2 磷酸果糖激酶（PFK）的研究与现状
• 1.3.2.1 磷酸果糖激酶（PFK）的研究进展
• 1.3.2.2 PFK 的催化过程
• 1.3.2.3 PFK 活性的测定方法
• 1.4 小单孢菌细胞膜的研究与现状
• 1.4.1 细胞膜的结构
• 1.4.2 细胞膜的作用
• 1.4.3 细胞膜对庆大霉素分泌的影响
• 1.5 本课题的研究意义和研究内容
• 1.5.1 研究意义
• 1.5.2 研究内容
• 第二章 RP-HPLC 检测己糖激酶活性新方法的创立
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 试剂和药品
• 2.2.3 流动相的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 色谱条件
• 2.3.2 标样的测定
• 2.3.2.1 ATP 和 ADP 的反向高效液相色谱分析
• 2.3.2.2 ADP 标准曲线的测定
• 2.3.2.3 精密度实验
• 2.3.3 HK 活性的测定
• 2.3.4 酶促反应中理化条件的确定
• 2.3.5 酶促反应动力学方程
• 2.3.6 RP-HPLC 法与酶偶联法的比较
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 标样的测定
• 2.4.1.1 ATP、ADP 色谱图
• 2.4.1.2 ADP 标准曲线
• 2.4.1.3 检测方法的精密度
• 2.4.2 理化条件对酶促反应的影响
• 2.4.2.1 温度对酶促反应的影响
• 2.4.2.2 pH 对酶促反应的影响
• 2.4.2.3 反应时间对酶促反应的影响
• 2.4.2.4 HK 酶量与酶活的关系
• 2.4.3 HK 酶促反应动力学方程
• 2.4.4 RP-HPLC 法与酶偶联法的比较
• 2.5 小结
• 第三章 绛红色小单孢菌中己糖激酶活性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 试剂与药品
• 3.2.4 常用溶液与缓冲液
• 3.2.5 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 绛红色小单孢菌的培养
• 3.3.2 绛红色小单孢菌菌悬液的制备
• 3.3.3 绛红色小单孢菌中 HK 粗酶液的制备
• 3.3.4 蛋白质含量的测定
• 3.3.4.1 Folin-酚法测定蛋白含量的原理
• 3.3.4.2 Folin-酚法测定蛋白含量的步骤
• 3.3.5 绛红色小单孢菌中 HK 活性的测定
• 3.3.5.1 HK 活性测定原理
• 3.3.5.2 色谱条件
• 3.3.5.3 HK 活性的测定步骤
• 3.3.5.4 绛红色小单孢菌中 HK 酶活力单位的定义
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 蛋白质标准曲线的测定
• 3.4.2 菌体细胞破碎条件的确定
• 3.4.3 最适盐析条件的确定
• 3.4.4 HK 酶促反应最适温度的确定
• 3.4.5 HK 酶促反应最适 pH 的确定
• 3.4.6 HK 回收率的测定
• 3.4.7 添加氨基酸对绛红色小单孢菌细胞中 HK 活性的影响
• 3.4.7.1 单独添加 Lys 对 HK 酶活性的影响
• 3.4.7.2 单独添加 Arg 对 HK 酶活性的影响
• 3.4.7.3 单独添加 Met 对 HK 酶活性的影响
• 3.4.7.4 同时添加三种氨基酸对 HK 活性的影响
• 3.5 小结
• 第四章 绛红色小单孢菌中磷酸果糖激酶活性的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 仪器设备
• 4.2.3 试剂与药品
• 4.2.4 常见溶液及缓冲液
• 4.2.5 培养基
• 4.2.6 绛红色小单孢菌的培养
• 4.2.7 绛红色小单孢菌菌悬液和粗酶液的制备
• 4.2.8 蛋白质含量的测定
• 4.2.9 绛红色小单孢菌中 PFK 活性的测定
• 4.2.9.1 色谱条件
• 4.2.9.2 PFK 活性的测定步骤
• 4.2.9.3 绛红色小单孢菌中 PFK 酶活力单位的定义
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 菌体细胞破碎条件的确定
• 4.3.2 最适盐析条件的确定
• 4.3.3 PFK 酶促反应最适温度的确定
• 4.3.4 PFK 酶促反应最适 pH 的确定
• 4.3.5 PFK 回收率实验
• 4.3.6 添加氨基酸对绛红色小单孢菌中 PFK 酶活性的影响
• 4.3.6.1 单独添加 Lys 对 PFK 酶活性的影响
• 4.3.6.2 单独添加 Arg 对 PFK 酶活性的影响
• 4.3.6.3 单独添加 Met 对 PFK 酶活性的影响
• 4.3.6.4 同时添加三种氨基酸对 PFK 酶活性的影响
• 4.4 小结
• 第五章 氨基酸对绛红色小单孢菌细胞膜的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 主要仪器设备
• 5.2.3 主要试剂与药品
• 5.2.4 常用溶液与缓冲液
• 5.2.5 培养基
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 绛红色小单孢菌斜面培养
• 5.3.2 绛红色小单孢菌种子培养
• 5.3.3 绛红色小单孢菌发酵培养
• 5.3.4 收获
• 5.3.5 庆大霉素效价的测定
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 庆大霉素标准曲线的制定
• 5.4.2 氨基酸对庆大霉素分泌的影响
• 5.4.2.1 氨基酸对庆大霉素分泌的影响
• 5.4.2.2 部分去除细胞壁后氨基酸对庆大霉素分泌的影响
• 5.5 小结
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历