检测犬狂犬病毒抗体的间接ELISA方法的建立

论文摘要

1.犬IgG的分离纯化和抗犬IgG单克隆抗体的制备采用辛酸-硫酸铵盐析和Hiload 16/60 superdex 200 prep pg凝胶柱层析法从犬血清中获得IgG,经SDS-PAGE电泳鉴定。用BCA法测定IgG浓度为2mg/ml。用纯化后的犬IgG,采用常规免疫法免疫6-8周龄雌性BABL/c小鼠。取三次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10:1混合,用0.7ml 50% PEG 4000进行细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得6株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对6株McAb初步鉴定结果表明,其抗体类型均为IgG1,轻链都为κ链。腹水的间接ELISA效价介于1.3×104～6.6×106之间。Western-Blotting试验证实有3株细胞为分泌针对犬IgG轻链抗体的杂交瘤细胞株,有3株细胞为分泌针对犬IgG重链抗体的杂交瘤细胞株。2.狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定用纯化的重组RV N蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得1A4、7H3、7H6、7F6及7F7 5株能稳定传代并分泌抗重组RV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。各单克隆抗体腹水间接ELISA效价在104-106之间。5株单克隆抗体的亚类均为IgG1,轻链均为κ链。Western-blot分析表明,所获得的5株单克隆抗体与重组RV N蛋白均具有反应性。间接免疫荧光染色显示,7F6与7F7可识别病毒感染Vero细胞中的RV N蛋白。3.抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定用纯化的原核表达的RV G蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,阳性孔经3次有限稀释法克隆,成功获得1株（1D10）能稳定传代并分泌抗重组RV G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。间接ELISA效价2.56×104。单克隆抗体的亚类均为IgG1,轻链均为κ链。间接免疫荧光染色显示腹水IFA效价为1:400。4.抗犬IgG单克隆抗体的纯化及其酶标记复苏稳定分泌抗犬IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D4,按常规方法制备腹水。用辛酸-硫酸铵及Protein G两步法纯化,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定,证明腹水经辛酸-硫酸铵及Protein G纯化后具有较高的纯度,可用于酶标记。采用过碘酸钠氧化法将犬IgG与辣根过氧化物酶连接,获得酶标鼠抗犬IgG,酶标记率为52.16%,克分子比为1.6;通过Dot-ELISA检测,发现HRP标记的鼠抗犬IgG在1:3000倍稀释时,可以与1024倍稀释的犬抗RV阳性血清起反应。5. NP-ELISA抗体检测方法的建立以原核表达的狂犬病毒核蛋白为抗原,建立了检测狂犬病毒抗体的间接ELISA方法。最佳反应体系为:抗原包被液为0.05M pH8.5的Tris-HCl缓冲液,抗原包被浓度为2ug/ml;封闭液为0.5%BSA/PBST,血清及二抗稀释液为含0.1% BSA的PBST缓冲液,待检血清的最佳稀释倍数为1:100,酶标抗体的最佳稀释倍数为1:2000;待检血清和酶标二抗孵育时间均为60min,底物反应时间10min。重复性试验、阻断性等试验表明,该方法重复性好、灵敏度高;与美国SYNBIOTICS试剂盒比较,本试剂盒的诊断敏感性为91.2%,特异性为90.7%,符合率为90.9%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 文献综述：狂犬病及狂犬病毒研究进展
• 第二部分 研究内容
• 第一章：犬IgG的分离纯化和抗犬IgG单克隆抗体的制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章：抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章：抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章：抗犬IgG单克隆抗体的纯化及酶标记
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章：NP-ELISA抗体检测方法的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 本研究主要成果
• 致谢
• 发表论文