萝卜带柄子叶离体再生体系的建立及遗传转化

论文摘要

以11个萝卜（Raphanus sativus L.）基因型为试验材料,就影响萝卜带柄子叶离体再生的主要因素进行了研究,建立了萝卜离体再生体系。以萝卜材料Z3作为遗传转化的材料,用携带有细胞质雄性不育基因orf138表达载体pWR-BcA9-orf138质粒的农杆菌进行了遗传转化体系研究,分别研究了预培养时间,共培养时间,侵染时间,农杆菌菌液浓度,抑菌剂种类浓度和延迟筛选等因素对萝卜遗传转化的影响。取得了以下结果:1.建立了萝卜子叶离体再生技术体系,其最佳外植体为全子叶-叶柄,最适苗龄为四天,诱导不定芽的最适培养基为MS + 6-BA 6 mg·L-1 +NAA 0.05 mg·L-1,再生率高达86.95%,再生系数为1.80。2.萝卜不同基因型其子叶再生不定芽的分化率存在较大差异。在相同浓度激素组合下,供试的11个萝卜品种中,以B2再生率最高为64.33%,B5再生率最低只有1.73%。3.适宜萝卜不定芽生根的培养基是1/2MS培养基添加0.3mg·L-1的NAA,其生根率最大达到了100%,根系发达率为75%,根系较粗壮,主根、须根都很明显,幼苗生长旺盛移栽后也易成活。4.在萝卜遗传转化中,选用500 mg·L-1 Cef做为抑菌剂可以有效控制农杆菌的污染;选用5 mg·L-1 Hyg做为选择压可以有效筛选抗性芽。5.建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜材料外植体先进行2天预培养,用OD600为0.3-0.6的EHA105农杆菌菌液侵染5-7 min后,再进行5天共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg·L-1 +NAA 0.05 mg·L-1 + Cef 500 mg·L-1的培养基上进行7天延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg·L-1 +NAA 0.05 mg·L-1 + Cef 500 mg·L-1 + Hyg 5 mg·L-1的培养基上进行10天的抗性筛选,每10天进行一次转接继代培养。6.用携带pWR- BcA9-orf138质粒的EHA105农杆菌转化萝卜材料Z3,获得了126个抗性芽,其中8个抗性芽PCR检测扩增出约850 bp的目的条带。初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 萝卜再生体系的建立
• 1.2.1 材料基因型对不定芽再生的影响
• 1.2.2 外植体类型和接种方式对不定芽再生的影响
• 1.2.3 外植体苗龄对不定芽再生的影响
• 1.2.4 外在因素对不定芽再生的影响
• 1.3 萝卜遗传转化体系的建立
• 1.3.1 主要转化方法
• 1.3.2 影响根癌农杆菌介导的因素
• 1.3.3 萝卜遗传转化研究进展
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 萝卜带柄子叶离体再生体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 基因型对萝卜再生的影响
• 2.2.2 外植体类型对萝卜再生的影响
• 2.2.3 不同激素配比对萝卜再生的影响
• 2.2.4 苗龄对萝卜再生的影响
• 2.2.5 生长素种类和浓度对萝卜不定芽生根的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 萝卜遗传转化体系的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 抗生素敏感试验
• 3.2.2 预培养和共培养时间对萝卜遗传转化的影响
• 3.2.3 菌液浓度和侵染时间对萝卜遗传转化的影响
• 3.2.4 延迟筛选和筛选时间对萝卜遗传转化的影响
• 3.2.5 转基因抗性芽的PCR 检测
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 4.1 萝卜带柄子叶离体再生体系的建立
• 4.2 萝卜遗传转化体系的建立
• 4.3 萝卜转基因抗性芽的获得及PCR 鉴定
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介