MDA对大鼠学习记忆能力和海马神经元钙稳态的影响

论文摘要

本论文是从整体动物水平和细胞分子水平研究脂质过氧化过程中的一个重要中间产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）对SD大鼠学习记忆能力的影响及对培养的海马神经元胞内钙离子稳态的破坏作用。在整体动物水平上,用Morrise水迷宫试验研究了经侧脑室注射不同浓度MDA的SD大鼠在定位航行试验（place navigation test,PNT）和空间探索试验（spatial probe test,SPT）中的行为变化。与生理盐水处理组和/或空白对照组相比,发现大鼠在定位航行试验中寻找水下平台的逃避潜伏期（escape latent period,ELP）极显著地延长（P＜0.01）,在空间探索试验中120s时间内穿越水下平台次数显著减少（P＜0.05）,说明不同浓度的MDA导致了大鼠在空间学习和记忆能力的降低。运用透射电子显微镜（transmission electronicmicroscope,TEM）比较观察了生理盐水组/空白对照组和不同浓度MDA处理组大鼠海马CA1区神经元亚细胞结构和超微结构的变化,发现MDA处理后的大鼠CA1区海马神经元细胞内线粒体结构变形,线粒体内的折叠结构和附着在上面的嵴减少或者消失,突触连接结构如突触后致密物质（postsynaptic density material,PSD）的厚度减少,突触界面（curvature of synaptic interface,CSI）的曲度增加,突触后活性区（active zone,AZ）的长度缩短,但突触间裂隙的宽度（synapticcleft,SC）没有显著变化。说明MDA处理后的大鼠海马神经元结构受到了损伤,从而引起了其在学习能力和空间探索寻找水下平台的记忆能力的下降。在细胞分子水平上,MDA作用于原代培养的SD大鼠海马神经元,研究了其在光学显微镜下细胞形态学上的变化及对神经元细胞内游离Ca2+浓度变化的影响。结果表明:在光学显微镜下,可以清楚地显示随着体系中MDA浓度的升高,对培养的海马神经元的毒害作用增强以至于神经元表现出死亡和/或凋亡的形态特征。在MDA的浓度为1.0～1000μmol/L,随着浓度的升高和时间的延长,表现出对质膜Ca2+-ATPase(plasma membrane Ca2+-ATPase,PMCA)活性的抑制作用增强;在MDA浓度为1.0～1000μmol/L和30min的作用时间内,胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)也显著升高,并且出了一个早期的逐渐的升高（0～10min）和一个晚期的快速升高过程（15～30min）。用尼莫地平（nimodipine）阻断由L-型钙通道（L-VOCC）开放引起的外钙内流,可以抑制晚期胞内[Ca2+]i升高,对早期胞内[Ca2+]i升高没有影响;过量的Ca2+螯合剂EGTA,同样可以抑制晚期胞内[Ca2+]i升高,而早期只在5min内有轻微地升高胞内[Ca2+]i,推测晚期胞内[Ca2+]i升高是由于质膜上L-VOCC开放,胞外Ca2+通过L-VOCC内流引起的;在体系中加入磷脂酶C（PL-C）活性抑制剂U73122,能抑制早期胞内[Ca2+]i的升高,推测早期胞内[Ca2+]i升高是由于MDA的作用激活了PL-C信号途径,使内质网（endoplasmic reticulum,ER）钙通道开放,ER钙库中的钙外流致胞内[Ca2+]i升高;在体系中加入蛋白质激酶A（PKA）抑制剂H-89,该抑制剂对胞内[Ca2+]i变化没有影响,推测cAMP/PICA信号途径可能没有参与MDA导致的胞内[Ca2+]i变化。1995年,印大中教授和Brunk教授共同提出羰基毒化衰老学说。该学说认为,生物体代谢过程中产生的不饱和醛酮类物质（如MDA,4-HNE）是导致个体衰老和退行性疾病形成的核心物质和造成熵增性衰老改变的关键过程。本论文探讨了由于MDA的应激作用,在整体动物水平上导致SD大鼠学习能力和空间记忆能力的下降,在神经元的形态结构、亚细胞结构和超微结构上也观察到了由于MDA的作用导致的形态结构上破坏,并在分子水平上探讨了MDA作用下的海马神经元胞内钙稳态的破坏及可能的作用机制。

论文目录

摘要

ABSTRACT

前言

第一章活性羰基类物质及衰老理轮

1.1 有关活性羰基类物质的生成、毒性和代谢

1.1.1 生物体内活性羰基类物质的产生

1.1.2 活性羰基类物质对生物的毒害作用

1.1.3 活性羰基类物质在生物体内的代谢

1.2 羰基应激衰老理论

1.2.1 脂质过氧化对生物的毒性

1.2.2 美拉德反应与生物衰老性变化

1.2.3 自由基氧化衰老学说

1.2.4 羰基应激衰老学说

1.3 抗衰老及衰老相关的防御机制

1.4 未来抗衰老研究的思路和防御羰基应激的方法

1.4.1 未来抗衰老研究的思路

1.4.2 防御羰基应激的方法

1.5 本论文的切入点与设计思路

第二章 MDA对大鼠学习记忆能力及海马神经元超微结构的影响

2.1 导言

2.2 材料与方法

2.2.1 试验动物及分组

2.2.2 试剂和试剂配制

2.2.3 仪器设备

2.3 方法

2.3.1 侧脑室注射MDA

2.3.2 Morris水迷宫试验

2.3.3 电镜样品的制备

2.3.4 突触结构的定量测定

2.4 数据处理

2.5 结果

2.5.1 Morris水迷宫试验

2.5.2 电镜观察

2.6 讨论

2+稳态影响'>第三章 MDA对大鼠海马神经元胞内Ca²⁺稳态影响

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 主要试剂

3.2.2 试剂配制

3.2.3 主要仪器

3.2.4 海马神经元原代培养

2+-ATPase活性的测定'>3.2.5 神经元突触膜Ca²⁺-ATPase活性的测定

2+浓度的测定'>3.2.6 海马神经元胞内游离Ca²⁺浓度的测定

3.2.7 数据分析

3.3 结果

3.3.1 MDA对培养的海马神经元形态结构的影响

2+-ATPase活性的影响'>3.3.2 MDA对突触质膜Ca²⁺-ATPase活性的影响

2+]_i的影响'>3.3.3 MDA对培养海马神经元胞质[Ca²⁺]_i的影响

2+]_i的影响'>3.3.4 尼莫地平和EGTA对培养的海马神经元胞质[Ca²⁺]_i的影响

2+]_i的影响'>3.3.5 醋甲胆碱和U73122对MDA处理体系[Ca²⁺]_i的影响

2+]_i的影响'>3.3.6 H-89对MDA处理体系中[Ca²⁺]_i的影响

2+]_i升高的机理'>3.3.7 MDA作用下胞内[Ca²⁺]_i升高的机理

3.4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

MDA对大鼠学习记忆能力和海马神经元钙稳态的影响

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