论文摘要
目的成体干细胞是维持组织稳态的重要因素，并在机体衰老进程中起关键作用。造血干细胞（hematopoietic Stem cells，HSCs）是干细胞研究领域中开展最早、技术最成熟、认识最深入并且广泛应用于临床的一种成体干细胞。衰老机体中造血系统基本成分虽然得以维持，但HSCs的功能和数量却逐渐降低，将导致免疫功能衰退和多种老年性疾病的发生。当归多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）是从当归中分离、提取的药用有效成分，具有促进造血、抗辐射损伤、抗肿瘤和免疫调节等作用。目前，有关ASP能否延缓HSCs衰老及其作用机制尚不清楚。本研究将干细胞研究技术和祖国传统的抗衰老医学理论相结合，采用HSCs体外衰老模型的复制和X线照射致小鼠HSCs衰老等现代生物学的研究手段，分别从体外与体内两条途径系统地探讨ASP调控HSCs衰老的作用及其可能的生物学机制，旨为重新激活衰老HSCs及调控其靶向分化提供实验依据和理论基础。方法1.免疫磁珠分选技术（magnetic-activated cell sorting，MACS）分离、纯化干细胞抗原-1（Sca-1+）HSCs，流式细胞术测定细胞分选纯度，台酚蓝染色检测细胞活性。2.采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察氧化低密度脂蛋白（oxidation lowdensity lipoprotein，ox-LDL）对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老模型。3. ASP与ox-LDL共培养Sca-1+HSCs，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化；酶学比色法测定细胞培养上清液超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；免疫荧光检测Sca-1+HSCs内活性氧（reactive oxygen specie，ROS）水平；荧光定量PCR及Western blot检测Sca-1+HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK4、cyclinD及cyclinE表达的变化；Southern blot和TRAP-PCR检测Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体外调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射（total body irradiation，TBI）小鼠，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析、甲基纤维素半固体培养等方法，观察X线TBI对小鼠对Sca-1+HSCs衰老生物学特性的影响，以建立小鼠Sca-1+HSCs体内衰老模型。5.小鼠X线3.0Gy/8F全身均匀照射期间给予ASP灌胃，采用SA-β-Gal染色、细胞周期分析及甲基纤维素半固体培养观察衰老生物学指标的变化；酶学比色法测定Sca-1+HSCs总抗氧化能力（totalanti-oxidant，T-AOC）；免疫荧光检测Sca-1+HSCs内ROS水平；荧光定量PCR及Western blot检测HSCs衰老相关基因p16、p21mRNA及细胞周期调控蛋白P16、P21、CDK2、CDK6、cyclinD及cyclin E表达的变化；Southern blot和TRAP-PCR测定Sca-1+HSCs端粒长度与端粒酶活性，以阐明3.0Gy/8F的X线TBI体内诱导Sca-1+HSCs衰老及ASP体内调控Sca-1+HSCs衰老的生物学机制。结果1. MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度为（86.216.17）%，显著高于分离纯化前Sca-1+细胞百分比为（11.451.87）%；台盼蓝染色法测定分选的Sca-1+HSCs活性为（93.65±4.54）%。表明分选的Sca-1+HSCs细胞有较高的纯度和良好的活性。2. ox-LDL体外诱导Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加；增殖能力明显减弱； G1期细胞比例显著升高、S期细胞比例显著减少；混合集落形成单位（colonyforming unit-mixture，CFU-Mix）数量显著减少。ox-LDL可诱导衰老Sca-1+HSCs培养上清液SOD、GSH-Px活性下降及MDA含量升高；细胞内ROS水平增加；端粒长度缩短，端粒酶活性降低；p16、p21mRNA及蛋白表达增强，CDK4、cyclinD及cyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。3. ASP体外作用于衰老Sca-1+HSCs可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率、G1期细胞比例及P16表达；增加S期细胞比例及CDK4、cyclinD蛋白表达；抑制端粒DNA损伤；而对CFU-Mix数量、ROS水平、细胞培养上清液SOD、GSH-Px活性与MDA含量、P21、CDK2、cyclinE蛋白表达及端粒酶活性均无明显影响。4. X线3.0Gy/8F全身均匀照射诱导小鼠Sca-1+HSCs呈现典型的衰老生物学表现：SA-β-Gal染色阳性细胞率明显增加； G1期细胞比例显著升高，S期细胞比例显著减少；CFU-Mix数量显著减少。3.0Gy/8F的X线可诱导衰老Sca-1+HSCs T-AOC下降，ROS水平增加；端粒长度缩短、端粒酶活性降低；p16、p21mRNA及蛋白表达增强，CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达降低，而对CDK2蛋白表达无影响。5. ASP体内作用于衰老Sca-1+HSCs后可降低其SA-β-gal染色阳性细胞率下降及G1期细胞比例、增加S期细胞比例及CFU-Mix数量；增加细胞T-AOC、降低ROS水平；抑制端粒DNA损伤，增强端粒酶活性；下调p16、p21mRNA及蛋白表达，上调CDK6、CyclinD及CyclinE蛋白表达，CDK2蛋白表达无显著性变化。结论1. MACS可有效分选小鼠Sca-1+HSCs，分离纯化的Sca-1+HSCs纯度较高，活性良好。2．ox-LDL可作为一种体外复制Sca-1+HSCs衰老模型的有效致衰剂。3．ASP体外作用可通过调节部分细胞周期调控蛋白表达及抑制端粒DNA损伤延缓ox-LDL诱导的Sca-1+HSCs衰老。4.3.0Gy/8F的X线全身均匀照射小鼠可诱导Sca-1+HSCs衰老以用于小鼠HSCs体内衰老模型的构建。5. ASP体内作用可通过抑制氧化应激损伤、调节细胞周期调控蛋白表达、抑制端粒DNA损伤及端粒酶活性下降以延缓X线TBI诱导的小鼠Sca-1+HSCs衰老。