论文摘要
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx子根的加工品，性味大辛大热，入心、脾、肾经，功效回阳救逆，补火助阳，散寒止痛，用于亡阳虚脱及阳虚诸证。现代研究证明附子具有强心、抗心律失常、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用，临床用于救治急性心肌梗塞所致的休克、低血压、冠心病及心绞痛等。附子始载于《神农本草经》，因其毒性剧烈，被列为“下品”。故附子的炮制被历代医家所重视，是祖国医药中通过炮制“减毒存效”的一个范例。现代研究已证实附子中主要毒效成分是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱，它们在炮制与蒸煮过程中易于水解而使附子毒性降低。附子炮制方法多样，质量控制也从最开始的“口尝目测”发展至“乌头碱限量检查”的现代方法。但现有炮制方法过分强调对附子的解毒作用，而未注意附子功效特点，其质量控制方法也仅局限于对附子理化性质考察，不符合中医辨证用药的特点，忽视了中药炮制、中医药理论对附子质量及药效、毒性、安全性的影响。因此，现有的附子炮制规范和控制标准，并不能完全保证附子质量，且极易导致附子的过度炮制，危及中医的临床应用。本课题作为国家科技攻关计划“中药疗效及安全性基本问题研究——含乌头碱中药附子理中丸安全性评价的示范研究”的一部分，前期研究结果发现，以高压蒸制方法对附子进行炮制，乌头碱、中乌头碱、次乌头碱三种双酯型生物碱均随着炮制时间的延长而含量降低，但次乌头碱在炮制过程中水解速度相对乌头碱、中乌头碱缓慢，动物实验中则发现三种双酯型生物碱都有强心作用，亦均有毒性，但以次乌头碱的强心作用最安全可靠。上述成果提示次乌头碱在评价附子饮片中具有潜在的积极价值。鉴于以上成果，本研究将首先对不同炮制时间的附子饮片进行安全性评价，优选出具有“回阳救逆”功效特点且安全范围较大的附子饮片。利用多元相关分析等统计学方法分析不同炮制时间饮片乌头碱、中乌头碱、次乌头碱含量变化与饮片TD50、ED50的相关性，明确附子炮制质量控制的物质基础。继而在细胞水平观察生物碱的心脏毒性表现，并探讨其导致心脏毒性的可能机制。本论文的主要研究内容及结果如下：1附子饮片双酯型生物碱含量变化与饮片安全性的相关性研究以附子“回阳救逆”功效为评价重点，通过对饮片心脏急性毒性及对心功能影响的观察，综合毒性、药效实验结果计算饮片的TD5 0、ED5 0和治疗指数，评价不同炮制时间附子饮片的安全性；通过对饮片在炮制过程中乌头碱、中乌头碱、次乌头碱含量变化与饮片毒性、药效相关性分析，探讨影响附子“回阳救逆”药效与心脏毒性表达的关键成分。1.1不同炮制时间附子饮片的心脏急性毒性研究以大鼠II导联心电图变化为指标，采用MedLab-U生物信号采集系统，大鼠十二指肠给予不同炮制时间附子饮片，观察30min内饮片对大鼠的心脏的毒性。以频发性室性早搏作为附子中毒的表现，对不同炮制时间附子饮片的心脏毒性进行评价，结果显示随着炮制时间的延长，附子饮片的心脏毒性逐渐降低，7种不同炮制时间饮片的TD50分别是0.4500g/kg、0.2185 g/kg、0.4925 g/kg、0.6190 g/kg、2.399 g/kg、2.009 g/kg、4.4060 g/kg。1.2不同炮制时间附子饮片对正常大鼠心功能影响的研究以心率、+dp/dtmax、LVSP、t-dp/dtmax等为指标，采用MedLab-U生物信号采集系统，大鼠十二指肠给予不同炮制时间附子饮片，侵入法（液压传导）监测大鼠左心功能，动态观察120min。记录各组动物给药前、给药后30min、60min、90min、105min、120min左心室LVSP、心率、+dp/dtmax、t-dp/dtmax等的变化，以给药前的左心功能上述指标为基础值，计算各组给药后上述指标的变化率均值和标准差。结果表明，7种附子饮片一定程度上能降低LVSP、心率、+dp/dtmax、t-dpdtmax等的变化率，说明其有一定的改善左心功能的作用。1.3不同炮制时间附子饮片的安全性评价序贯法计算7种饮片心脏毒性的TD50；Bliss法计算7种饮片改善心功能作用的ED50（+dp/dtmax、LVSP），按公式TI=TD50/ED50，评价不同炮制时间附子饮片的安全范围。分别以LVSP、+dp/dtmax为指标计算不同炮制时间附子ED50，随着炮制时间延长而增大，说明其药效降低。提示炮制过程中可能存在有效成分的流失，继而引起改善心功能作用的减弱。而从不同炮制时间附子的TI可见，炮制100min的附子饮片（5号）的安全范围大于其它炮制时间饮片。1.4附子饮片双酯型生物碱含量变化与饮片安全性的相关性研究将7种饮片的ED50、TD50、TI值与饮片中乌头碱、中乌头碱、次乌头碱含量检测结果相关联，分析三种双酯型生物碱含量变化与饮片药效、毒性及安全性的关系；多元线性相关分析评价乌头碱、中乌头碱、次乌头碱与饮片毒性、药效相关性。当饮片中有较高含量的乌头碱、中乌头碱、次乌头碱（炮制540min），饮片的改善心功能作用、心脏毒性均较强且不规律。炮制100180min的附子（57号），饮片中已无乌头碱，中乌头碱、次乌头碱含量逐渐减少，其改善心功能作用和心脏毒性下降，炮制100min（5号）饮片的安全性最好。饮片中乌头碱含量的变化与饮片心脏毒性TD50呈正相关（与毒性评分呈负相关），次乌头碱含量的变化则与饮片TD50呈正相关（与毒性评分呈负相关）或无相关性，中乌头碱含量的变化与饮片TD50呈负相关（与毒性评分呈正相关）；分别以LVSP、+dp/dtmax为指标计算的7种饮片的2个ED50，均与次乌头碱含量变化呈正相关性，与乌头碱、中乌头碱含量变化的相关性因不同分析方法而有差别。小结：经加压高温蒸制100min的附子饮片“回阳救逆”作用和安全性明显优于其他炮制时间饮片；附子三种双酯型生物碱中，次乌头碱的含量变化与附子“回阳救逆”功效饮片密切相关，次乌头碱可作为用于“回阳救逆”作用的附子饮片的质量控制标准之一。2次乌头碱对原代培养心肌细胞的毒性研究由于次乌头碱与饮片的“回阳救逆”（改善心功能）及心脏毒性作用存在明显的相关性，故研究次乌头碱的心脏毒性及机制，对于实现附子饮片的“减毒存效”有重要意义。本研究通过观察次乌头碱对心肌细胞搏动频率、细胞活力、细胞膜LDH漏出率等的影响，明确次乌头碱致心肌毒性的时–毒关系和量-毒关系。2.1建立心肌细胞原代培养体系采用改良的Simpson法培养心肌细胞，胎盼蓝染色检测细胞的存活率大于90%，培养23天后倒置显微镜下观察，心肌细胞完全贴壁生长，细胞为梭形、菱形或多角形，伸出伪足，并聚集成簇，有规律的自发性搏动。培养48hrs后的心肌细胞经α-Sarcomeric actin多克隆抗体染色阳性，Fibronectin多克隆抗体染色阴性，提示心肌细胞阳性率≥95%。本实验中采用的心肌细胞原代培养方法成熟可靠，保证了以心肌细胞为研究对象所进行的次乌头碱心脏毒性实验的可信性和科学性。2.2次乌头碱对原代培养的心肌细胞搏动频率的影响镜下观察不同浓度次乌头碱给药后5min、15min、30min、60min心肌细胞搏动变化情况，并用数码相机对心肌细胞的搏动进行记录，计算搏动频率。心肌细胞正常培养4天后，自发搏动频率为5070次/分。次乌头碱对心肌细胞自发搏动频率的影响有时间依赖性和剂量依赖性。660μM/L次乌头碱引起心肌细胞搏动频率加快，持续时间在给药后530min；当剂量≥60μM/L时，给药后即刻出现细胞停搏现象。2.3次乌头碱对原代培养的心肌细胞活力的影响MTT比色法评价次乌头碱对心肌细胞活力的影响。120μM/L次乌头碱，给药60min，对心肌细胞活力产生一定的损伤，细胞活力下降约15%左右，但次乌头碱对心肌细胞活力的损伤作用较弱，各剂量和各时间点内结果统计均无显著性差异。2.4次乌头碱对原代培养的心肌细胞膜LDH漏出率的影响以不同浓度次乌头碱给药15min、30min、60min后心肌细胞膜LDH漏出率，评价次乌头碱的心肌细胞毒作用。细胞LDH漏出率增大即反映了细胞膜通透性的改变，细胞受损。结果显示，给药1560min，随着剂量的增加，次乌头碱致心肌细胞膜LDH的漏出率明显增大。2.5次乌头碱对原代培养的心肌细胞形态的影响镜下观察次乌头碱给药后15min、30min、60min、120 min时间内心肌细胞形态改变，并用数码相机拍照记录。次乌头碱对心肌细胞的形态影响呈现出一定的时间依赖性和剂量依赖性。心肌细胞随着次乌头碱剂量的增加（30120μM/L）和作用时间的延长（0120min），镜下可见心肌细胞胞浆皱缩变小，伪足减少，突起缩短；细胞表面呈泡状突起，形成类似“菜花状”的大泡；胞浆内黑褐色的沉着斑点增多；部分心肌细胞脱壁死亡，镜下可见漂浮的死亡心肌细胞（120μM/L，120min）。小结：次乌头碱对心肌细胞有确切的毒性损伤作用，损伤程度与次乌头碱的浓度及作用时间有关。较低浓度（≤60μM/L）次乌头碱在短时间（530min）内即引起心肌细胞搏动频率加快，并偶可见到搏动频率不齐现象，但作用时间延长（≥30min）后，心肌细胞的搏动频率又逐渐减弱，同时细胞LDH漏出率增加，出现细胞膜受损、细胞活力下降；高浓度（≥60μM/L）次乌头碱给药后立即导致心肌细胞停搏，并在较短的时间（530min）内使心肌细胞膜受损、细胞活力下降、细胞死亡。3次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白相关基因表达的影响心肌细胞内“钙超载”和细胞内钙的调控紊乱是心律失常发生的主要机制之一。心肌细胞L-型钙通道、Na通道、CaM、RyR2、NCX等钙调控相关蛋白的异常表达或功能障碍会导致心肌细胞钙稳态受到破坏，钙超载，发生心律失常。本研究通过观察次乌头碱对上述钙调控蛋白mRNA表达的影响，分析次乌头碱导致心律失常与Ca2+/CaM信号转导通路的关系。3.1次乌头碱对原代培养心肌细胞内Ca2 +的影响Fluo-3-AM负载心肌细胞内的游离Ca2+，经流式细胞仪检测，反映不同浓度次乌头碱给药15min、30min、60min后细胞[Ca2+]i的变化情况。30120μΜ/L次乌头碱引起心肌细胞内游离Ca2+浓度升高。细胞“钙超载”出现在给药后15min（P＜0.01），且呈一定的剂量依赖性。共同孵育30min和60min后，荧光强度与空白对照组比较增加不明显，亦无明显的时间依赖性。3.2次乌头碱对心肌细胞膜L-Ca通道、Na通道SCN5A亚基、NCX的mRNA表达的影响实时荧光定量PCR法检测不同浓度次乌头碱与心肌细胞共同孵育15min后细胞膜上L-Ca通道、Na通道SCN5A亚基、NCX的mRNA的表达情况，并比较次乌头碱与心肌细胞共同孵育5min、15min、60min后上述指标的变化。与空白对照组比较，60μΜ/L和120μΜ/L次乌头碱能降低心肌细胞膜上L-Ca通道α1C、Na通道SCN5A及NCX mRNA的荧光CT值，说明在次乌头碱作用下，心肌细胞膜上的L-Ca通道、Na通道及NCX的基因表达量增多（P＜0.05），并且呈一定的剂量依赖性，但无明显的时间依赖性。60μM/L次乌头碱在5min时即可引起细胞膜上L-Ca通道α1C亚基基因表达量增多（P＜0.05），次乌头碱对心肌细胞作用30min时，心肌细胞膜上Na通道及NCX mRNA的表达量才明显增多（P＜0.05）。3.3次乌头碱对心肌细胞CaM mRNA表达的影响实时荧光定量PCR法检测不同浓度次乌头碱与心肌细胞共同孵育15min后细胞内CaM mRNA表达情况，并比较次乌头碱与心肌细胞共同孵育5min、15min、60min后上述指标的变化。与空白对照组比较，30μΜ/L、60μΜ/L和120μΜ/L次乌头碱均能降低心肌细胞CaM mRNA的荧光CT值，说明在次乌头碱作用下，心肌细胞CaM的基因表达量增多（P＜0.01），但无明显的剂量依赖性和时间依赖性。30μM/L次乌头碱作用15min、60μM/L次乌头碱作用15min和60min，心肌细胞内的CaM基因表达量增多（P＜0.01）。3.4次乌头碱对心肌细胞肌浆网RyR2mRNA表达的影响实时荧光定量PCR法检测不同浓度次乌头碱与心肌细胞共同孵育15min后细胞肌浆网上RyR2 mRNA表达情况，并比较次乌头碱与心肌细胞共同孵育5min、15min、60min后上述指标的变化。与空白对照组比较，60μΜ/L、120μΜ/L次乌头碱能降低心肌细胞肌浆网RyR2 mRNA的荧光CT值，说明在次乌头碱作用下，肌浆网RyR2的基因表达量增多（P＜0.05），但无时间依赖性。小结：次乌头碱（60μΜ/L、120μΜ/L）能升高心肌细胞L-型Ca通道、NCX、Na通道、CaM及肌浆网RyR2 mRNA表达量（P＜0.05或P＜0.01）。上述通道蛋白和钙调蛋白mRNA表达量的提高说明其蛋白表达增多，活性增强，通过CICR机制细胞内Ca2+浓度急剧增多，造成细胞内的“钙超载”。此外，次乌头碱对心肌细胞钙调控蛋白的调控可能存在“阈浓度”，只有浓度大于60μΜ/L，上述钙调蛋白的mRNA表达才会出现显著的增强（P＜0.01或0.05）。上述结果提示，次乌头碱可能通过心肌细胞内Ca2+/CaM信号传导通路导致心律失常的发生。4次乌头碱对心肌细胞缝隙连接蛋白Connexin43表达影响心肌细胞间GJ及其主要连接蛋白Cx43参与了心律失常和心肌损伤发生、发展过程。GJ及CX43数量、密度、空间分布和功能状态的异常会影响心肌细胞间动作电位的扩布和病理状态下“有害物质”在细胞间的传递，从而导致心律失常的发生和心肌病理性损伤。次乌头碱能降低体外原代培养心肌细胞的Cx43表达水平，并呈一定的剂量依赖性。小结：次乌头碱能降低心肌细胞缝隙连接Cx43表达水平，呈一定的剂量依赖性。Cx43表达量下降能增加心肌细胞发生心律失常的易感性，但亦有可能是心肌细胞在外来毒害物质（次乌头碱）或心律失常发生条件下的一种自我保护性反应。结论：通过实验研究，可以得出以下结论：1．附子饮片炮制应充分考虑附子功效特点。利用药效及毒性评价方法，结合中药炮制手段及含量检测技术，优选出具有“回阳救逆”特点的附子饮片。2．饮片中次乌头碱含量的变化与“回阳救逆”附子的功效及心脏毒性密切相关，次乌头碱可作为附子质量控制的参考标准之一。3．次乌头碱可引起心肌细胞搏动频率、形态、活力、细胞膜通透性的变化。4．次乌头碱可引起心肌细胞内钙超载，最终引起心肌细胞搏动频率紊乱和停搏。5．次乌头碱可导致心肌细胞内钙调控蛋白L-钙通道、Na通道SCN5A亚基、NCX、CaM、RyR2的mRNA转录水平表达增强。6．次乌头碱可导致心肌细胞缝隙连接Cx43蛋白表达下降，Cx43参与了次乌头碱作用下的心律失常的发生和心肌的自我保护过程。7．乌头碱、中乌头碱、次乌头碱在整体、离体和细胞水平，均能引起心律失常；在细胞水平，均能导致心肌细胞形态、活力、细胞膜通透性的变化；其中乌头碱的毒性最大，中乌头碱与之相似或略低，次乌头碱毒性最小。8．次乌头碱导致心律失常的机制与乌头碱类似，即抑制心肌细胞钠通道失活，增强细胞内钙调控蛋白RyR2和NCX基因转录和蛋白表达增加，诱发细胞内“钙超载”，本研究中还发现次乌头碱对L-钙通道有激活作用，并可通过降低心肌细胞缝隙连接Cx43蛋白表达，增加心肌细胞发生心律失常的易感性。课题创新点：1．利用药效及毒性评价方法，优选出具有“回阳救逆”功效特点的附子饮片，并分析了双酯型生物碱含量变化与附子饮片安全性之间的相关性，提出次乌头碱在附子饮片质量控制中具有重要参考价值。2、首次在细胞水平观察了次乌头碱心肌毒性的量-毒关系和时-毒关系。并从Ca2+ /CaM信号转导途径研究了次乌头碱导致心律失常发生的机制。3、首次研究了细胞缝隙连接通讯在次乌头碱引起的心律失常中的作用。