共轭亚油酸高产菌株的诱变选育及高效转化技术的研究

论文摘要

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid,CLA）是一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸的总称,具有抗癌、抗动脉粥样硬化、参与脂肪分解与代谢、调节血糖和血脂、增强机体免疫能力和促进生长等多种生理活性,是近20年人类发现的最重要的功能性油脂酸之一。本研究以具有益生作用的乳酸菌为研究对象,通过筛选获得具有共轭亚油酸转化能力的菌株A6-1,再经离子注入技术进行诱变选育得到突变株A6-1F;通过产酶条件的优化,获得具有高活性的菌体细胞,以磷酸-柠檬酸缓冲液为反应体系开展了菌体细胞酶特性的研究,最后,开展了菌体细胞在振荡水浴、超声水浴、超临界CO2流体中转化效率的研究,并探讨了菌体细胞在超声波水浴和超临界CO2流体中高效转化的机制。本论文研究的主要结果如下:40株乳酸菌中具有CLA转化能力的8株,其中A6-1和SL-3的转化能力较高。经分离、纯化和API 50乳酸菌鉴定系统的分析,确定A6-1和SL-3均为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）;菌株A6-1和SL-3发酵液中CLA的组成主要是c9,t11和t10,c12 CLA两种活性异构体。A6-1发酵液中c9,t11和t10,c12 CLA的含量分别为61.554μg/mL和14.235μg/mL,SL-3发酵液中c9,t11CLA,t10,c12CLA的含量分别为46.161μg/mL和8.7399μg/mL。影响植物乳杆菌A6-1转化共轭亚油酸发酵条件的研究表明,反应温度、初始pH、底物LA浓度、培养时间、接种浓度等对植物乳杆菌A6-1转化CLA能力具有明显的影响。在反应温度37℃,初始pH值7.0,反应时间32h,底物亚油酸（LA）的浓度为1mg/mL,接种浓度2%时,植物乳杆菌A6-1转化共轭亚油酸的产量可达91.4μg/mL。底物浓度对该菌转化生成CLA的能力有抑制作用,但是该菌对底物抑制作用有一定的耐受性。以A6-1为出发菌株,采用N+离子注入的方法进行诱变处理,注入能量为50keV,注入剂量为1×1013、3×1013、5×1013、8×1013、10×1013、30×1013、50×1013、80×1013、100×1013ions/cm2,真空度为10-3Pa,菌体的存活率随离子注入剂量的增加呈明显的“马鞍型”曲线,“鞍脊”出现在30×1013～50×1013ions/cm2处,此时菌体的存活率在20～35%之间,综合考虑存活率、总突变率、正突变率和突变幅度等因素,30×1013ions/cm2作为A6-1适宜的诱变剂量。挑取的突变株中,CLA的转化能力提高50%以上的有25个,经8次传代CLA的生成量没有明显降低的有6个突变株。其中被命名为A6-1F的稳定性最好,CLA产量最高,为162.5μg/mL,比出发菌株的95.66μg/mL提高了69.8%。诱变选育的高产菌株A6-1F的适宜产酶条件为:种子液中添加0.4mg/mL的LA进行诱导,种子液的菌龄20h,底物浓度0.75mg/mL,接种量4%、pH7.0,培养时间32h。在适宜的条件下,亚油酸异构酶的活性为337.4U/mL。采用甲苯、氯仿、丙酮等有机溶剂对植物乳杆菌A6-1F进行透性化处理,菌体A6-1F透性化细胞转化CLA的能力未能显著高于菌体的冻融细胞;冻融细胞转化底物生成CLA的能力比鲜细胞平均高20%。A6-1F菌体细胞酶反应的最适温度为35～37℃,菌体细胞的亚油酸异构酶对温度敏感,45℃保温60min和120min剩余细胞酶转化CLA能力不足最适温度直接反应产生CLA量的50%;细胞酶反应的适宜pH为6.0～7.0,最适pH为7.0,在偏酸性条件下（6.0～7.0）,细胞酶对pH相对稳定。底物浓度为2.0mg/mL时,细胞浓度25%,反应温度36±1℃时,反应液中CLA的生成量为275.7μg/mL。菌体细胞酶的催化效率为:超临界CO2反应体系＞超声水浴反应体系＞振荡水浴反应体系;超临界CO2流体反应体系下,细胞浓度15%,底物浓度1.5mg/mL,反应时间30min时,产物的生成量为0.623mg/mL,转化率达41.5%。超临界和超声条件下的菌体细胞转化率提高的原因在于超声和超临界条件导致菌体细胞的破裂,内容物外溢,以及超临界CO2流体增加了细胞的通透性,致使更多的胞内酶释放到胞外,增加了相互作用的机会。超声和超临界CO2流体条件下能有效提高菌体细胞酶转化效率,具有广阔的应用前景,具有进一步研究和开发的价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 共轭亚油酸的结构和稳定性
• 1.2 共轭亚油酸的生理功能
• 1.2.1 抗癌功能
• 1.2.2 免疫调节
• 1.2.3 降脂减肥功能
• 1.2.4 抗动脉粥样硬化
• 1.2.5 防治糖尿病
• 1.2.6 改善骨组织代谢
• 1.3 生物合成共轭亚油酸的研究状况
• 1.3.1 产共轭亚油酸菌的研究
• 1.3.2 产共轭亚油酸益生菌的选育和转化条件的研究
• 1.3.3 亚油酸异构酶及作用机制的研究
• 1.3.4 亚油酸异构酶的基因水平的研究
• 1.3.5 亚油酸异构酶酶促反应体系的研究现状
• 1.4 超临界反应体系的研究
• 1.5 透性化细胞酶的研究
• 1.6 离子注入技术的应用研究
• 1.6.1 离子注入诱变作用的机制
• 1.6.2 离子诱变育种的特点
• 1.6.3 离子注入诱变微生物育种的方法
• 1.6.4 离子诱变育种的研究和应用
• 1.7 本研究的内容、目标、意义
• 1.7.1 研究的内容
• 1.7.2 研究的目标
• 1.7.3 研究的意义
• 第二章 共轭亚油酸高产菌株的筛选和鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 主要试剂
• 2.2.5 菌种活化
• 2.2.6 发酵方法
• 2.2.7 样品制备及CLA测定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 CLA转化菌株的筛选
• 2.3.2 生物发酵法获得CLA的组成分析
• 2.3.3 CLA转化菌株的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 植物乳杆菌产共轭亚油酸的影响因素的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 主要试剂
• 3.2.5 菌种活化和发酵
• 3.2.6 培养条件
• 3.2.7 菌体生物量的测定
• 3.2.8 样品的制备和CLA测定方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 接种浓度对CLA产量的影响
• 3.3.2 培养时间对CLA产量的影响
• 3.3.3 底物浓度对CLA产量的影响
• 3.3.4 培养温度对CLA产量的影响
• 3.3.5 初始pH对CLA产量的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 离子注入诱变选育CLA高产菌株
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要仪器设备
• 4.2.4 主要试剂
• 4.2.5 菌种活化
• 4.2.6 菌株的诱变处理
• 4.2.7 菌体计数和发酵方法
• 4.2.8 样品的制备和测定方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 离子注入诱变效应的研究
• 4.3.2 诱变高产菌株遗传稳定性的研究
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 植物乳杆菌A6-1F产亚油酸异构酶产酶条件优化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要仪器设备
• 5.2.4 主要试剂
• 5.2.5 菌种活化
• 5.2.6 菌体的培养和细胞的收集
• 5.2.7 粗酶液的制备和酶活力的测定
• 5.2.8 各影响因素的处理方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 预培养底物浓度对共轭亚油酸异构酶活性的影响
• 5.3.2 底物浓度对共轭亚油酸异构酶活性的影响
• 5.3.3 不同培养时间对共轭亚油酸异构酶活性的影响
• 5.3.4 接种量对共轭亚油酸异构酶活性的影响
• 5.3.5 初始pH对CLA异构酶活性的影响
• 5.3.6 种子液的菌龄对亚油酸异构酶活性的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 菌体细胞酶转化共轭亚油酸的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 菌种
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 主要仪器设备
• 6.1.4 主要试剂
• 6.1.5 菌种活化
• 6.1.6 菌体培养和菌体细胞的制备
• 6.1.7 透性化细胞的制备
• 6.1.8 细胞酶的特性和适宜反应体系的研究
• 6.1.9 脂肪酸的提取和CLA测定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 透性化方法的选择
• 6.2.2 反应初始pH对细胞酶转化CLA的影响和细胞酶的pH稳定性
• 6.2.3 反应温度对细胞酶转化CLA的影响和细胞酶的温度稳定性
• 6.2.4 反应体系中细胞浓度对细胞酶转化能力的影响
• 6.2.5 反应体系中底物浓度对细胞酶转化能力的影响
• 6.3 讨论
• 6.4 本章小结
• 第七章 超声和超临界条件下菌体细胞转化进程及高效机制的探讨
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌种
• 7.2.2 培养基
• 7.2.3 主要仪器设备
• 7.2.4 主要试剂
• 7.2.5 菌种活化
• 7.2.6 菌体培养和菌体细胞的制备
• 7.2.7 细胞酶反应条件
• 7.2.8 SDS-PAGE电泳
• 7.2.9 样品的制备和CLA测定
• 7.2.10 菌体形态的电镜观察
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 菌体细胞酶在振荡水浴中的反应进程
• 7.3.2 菌体细胞在超声水浴中的反应进程
• 7.3.3 菌体细胞在超临界环境下的反应进程
• 7.3.4 超声和超临界条件下高效转化机制的探讨
• 7.4 讨论
• 7.5 本章小结
• 第八章 全文总结与展望
• 8.1 本文的研究总结
• 8.2 论文的创新点
• 8.3 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章
• 论文图表统计