论文摘要
缺血性脑血管病（Ischemic Cerebrovascular Disease,ICVD）是由脑部血液循环障碍,导致以局部神经功能损伤、缺失为特征的一组疾病。ICVD具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多等特点,是引起人类致残、死亡的最主要疾病之一,给人类的身体健康造成了极大的伤害。因此,寻找与开发防治缺血性脑血管病的理想药物己日益受到国内外的广泛重视,成为当前医药学界工作者特别关注的研究课题。黄芪是我国传统中药,为豆科植物蒙古黄芪（Astraglus membranaceus Bge. var monghaalicus Hsiao）或膜荚黄芪（A. membranaceus Bge）的干燥根,其中含有皂苷类、黄酮类及苷类、糖类、多种氨基酸及微量元素。黄芪总苷（Astragalosides,AST）作为其主要成分具有抗氧化、免疫调节、促智等作用,临床常用于防治心脑血管疾病、促智、延缓衰老、免疫功能紊乱性疾病和抗肿瘤等多种疾病。本课题采用大鼠线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型和海马神经元缺氧/复氧模型,从以下几个方面对黄芪总苷进行研究,以探讨其对脑缺血再灌注损伤后神经功能和学习记忆功能恢复的保护作用及其机制。第一部分黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能的影响及其作用机制研究在MCAO大鼠模型上,研究了AST对脑缺血再灌注后7d大鼠学习记忆功能的影响及其机制。采用Morris水迷宫,观察AST对逃避潜伏期和游泳距离的影响;采用免疫组化的方法检测NGF和BDNF蛋白的表达;采用Western blot检测p-ERK1/2、p-JNK和p-Akt活性。实验结果显示:与模型组比较,AST（80mg/kg）可以明显缩短5d、6d和7d逃避潜伏期和游泳距离,AST（40mg/kg）可以缩短6d和7d的潜伏期和5d、6d和7d的游泳距离,AST（20mg/kg）可以缩短7d的潜伏期和6d和7d的游泳距离。AST（20,40、80mg/kg）可以增加NGF和BDNF蛋白的表达;AST（40、80mg/kg）可以上调p-ERK和p-Akt的表达、下调p-JNK的表达,可能是其发挥脑保护作用的机制之一。第二部分黄芪总苷对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制研究在MCAO大鼠模型上,研究了AST对脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d大鼠的保护作用及其机制。观察了AST对模型大鼠体重、神经功能评分、脑指数、脑含水量和脑梗死体积的影响;检测脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮合酶（NOS）活性,丙二醛（MDA）、乳酸（LD）和一氧化氮（NO）含量;采用苏木素-伊红（HE）染色观察脑组织病理改变;采用RT-PCR检测iNOSmRNA、NGFmRNA、BDNFmRNA和p75NTRmRNA的表达;采用real-time PCR检测TrkAmRNA和TrkBmRNA的表达。实验结果如下:1脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠体重均有明显降低,AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高降低的模型大鼠体重。2模型大鼠在缺血再灌注1d时,神经功能评分最高,然后逐渐降低,14d时基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d可以明显降低模型大鼠升高的神经功能评分。3脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑指数均有明显增高,14d模型组大鼠脑指数恢复至正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显降低脑指数的增加。4脑缺血再灌注后1d模型组大鼠脑含水量已经明显增加,随着再灌注的进行,含水量逐步增加,在再灌注3d达到高峰,然后开始下降,7d仍有增加,至14d已经恢复正常。AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显减轻大鼠缺血再灌注后脑组织含水量的增加。5脑缺血再灌注后出现明显的梗死灶,缺血再灌注3d时脑梗死体积最大。AST （40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显减轻大鼠缺血再灌注后脑梗死体积。6脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织SOD活力明显降低和MDA含量明显升高;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显升高SOD活性、降低脑组织中MDA含量。7脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织LDH活力明显下降、LD含量明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显升高脑组织中LDH活性、降低脑组织中LD含量。8脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织NO含量、NOS活力明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显降低脑组织中NO含量和NOS活性。9脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织iNOSmRNA表达明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显降低脑组织中iNOSmRNA表达。10 AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以不同程度的减轻脑缺血再灌注大鼠脑组织的病理损害。11脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠脑组织NGFmRNA表达明显升高,7d达到高峰;AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高脑组织中NGFmRNA。12脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠脑组织BDNFmRNA表达明显升高,3d达到高峰;AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高脑组织中BDNFmRNA。13脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织p75NTRmRNA表达明显升高,3d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显降低脑组织中p75NTRmRNA。14缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织TrkAmRNA表达明显升高,7d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）7d和14d可以明显升高脑组织中TrkAmRNA。15缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织TrkBmRNA表达明显升高,7d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显升高脑组织中TrkBmRNA。第三部分黄芪总苷对海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其作用机制研究在原代培养的海马神经元缺氧/复氧（A/R）模型上,研究了AST对A/R诱导的海马神经元损伤的保护作用及其作用机制。采用MTT和LDH释放率法,检测海马神经元的活力;检测细胞上清液中SOD活性、MDA和NO含量;采用荧光素染料Hoechst33258染色法,测定海马神经元凋亡;采用Annexin-V/PI双染法,在流式细胞仪上检测细胞凋亡;采用Fluo-3/AM染色,测定海马神经元内[Ca2+]i的变化。结果显示,缺氧复氧组海马神经元活力明显降低;缺氧前加入AST（10、20、40μg/ml）可以明显提高海马神经元的活力,缺氧后复氧前加入AST（40μg/ml）可以提高海马神经元的活力。A/R组海马神经元LDH的释放率明显升高;AST（10、20、40μg/ml）可以明显降低A/R后海马神经元的LDH释放率。A/R后海马神经元培养上清液中SOD活性明显降低,MDA、NO含量明显升高; AST（10、20、40μg/ml）可以明显升高上清液中SOD活性、降低MDA和NO含量。A/R组表现出明显的细胞凋亡;与A/R组比较,AST（10、20、40μg/ml）可以明显减轻缺氧复氧后海马神经元的凋亡率,显著降低胞浆内钙离子的平均荧光强度。结论:本文研究了黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用和对学习记忆功能的影响,并对其作用机制进行了探索。研究发现黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤后的学习记忆功能有明显的保护作用,其作用机制涉及抗氧化、促进NGF、BDNF及其高亲和力受体TrkA、TrkB的表达、抑制低亲和力受体p75NTR的表达、抑制细胞凋亡、上调p-ERK和p-Akt的表达、下调p-JNK的表达等有关。