论文摘要
皮肤干细胞存在于毛囊突起处,称为毛囊干细胞,通过自我更新维持毛囊周期循环、表皮新陈代谢以及参与皮肤创伤愈合等。干细胞自我更新方式主要是通过不对称分裂产生一个干细胞和短暂增殖细胞,能够维持干细胞数目的稳定,同时通过短暂增殖细胞的增殖和分化维持组织器官的新陈代谢。毛囊干细胞自我更新异常会导致皮肤肿瘤发生以及创伤愈合延迟等。目前对于毛囊干细胞稳态维持的分子机制还知之甚少。我们以前的研究显示角质细胞特异性敲除Smad4基因导致小鼠发生皮肤肿瘤。该小鼠是阐述Smad4基因与毛囊干细胞自我更新以及皮肤肿瘤发生的关系的良好动物模型。本研究中我们发现Smad4基因表达于正常静息期的毛囊干细胞,提示Smad4在维持毛囊干细胞自我更新过程中可能发挥重要作用。LacZ染色显示角蛋白5（keratin 5, K5）指导的Cre重组酶表达于毛囊干细胞并能够介导Smad4基因在毛囊干细胞内敲除。Smad4基因敲除小鼠表皮和毛囊角质细胞增殖明显加快,导致6月龄左右小鼠的表皮、毛囊和皮脂腺肥大,并且Smad4基因敲除小鼠在8月龄以前发生皮肤肿瘤。那么Smad4基因敲除小鼠的皮肤肿瘤发生以及表皮肥大是否与毛囊干细胞的自我更新异常相关呢?我们利用干细胞代谢周期缓慢的特点,用溴代脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine,BrdU）标记滞留的方法来检测毛囊干细胞:对出生后10天小鼠4次腹腔注射BrdU,使其能够掺入到所有增殖细胞的基因组内,经过2个月左右的间隔后检测细胞内的BrdU信号,此时体细胞由于细胞周期快已经将BrdU代谢丢失,而毛囊干细胞细胞周期缓慢还保留有BrdU标记。在注射BrdU60天后进行检测发现,对照小鼠中BrdU标记滞留细胞（label retaining cells,LRCs）都集中在毛囊突起,而在Smad4基因敲除小鼠BrdU标记滞留细胞的范围扩散到整个毛囊。同时用增殖性核抗原Ki67标记处于增殖期的细胞,在对照小鼠中,BrdU标记滞留的细胞Ki67绝大部分为阴性,说明正常的毛囊干细胞处于静息状态;而在基因敲除小鼠中BrdU/Ki67双阳性的细胞较对照小鼠明显增多（11.2±5.0%比2.9±2.5%）,提示Smad4基因敲除导致了毛囊干细胞的过度活化。毛囊干细胞开始增殖、细胞周期加快,标记的BrdU必然会较快的被代谢掉,将检测BrdU的时间延长至标记后77天,发现在敲除小鼠毛囊已经检测不到BrdU信号,而对照小鼠依然保留有较强的BrdU信号,这印证了Smad4基因敲除导致了毛囊干细胞过度活化的观点。Smad4基因敲除小鼠毛囊干细胞的过度活化最终导致毛囊干细胞的分子标记物K15和CD34表达显著降低。用CD34和α6-integrin抗体对毛囊干细胞进行流式分选,出生后72天Smad4基因敲除小鼠中干细胞数较对照小鼠显著减少（2.0±1.3%比13.2±5.5%）,提示Smad4基因敲除小鼠中干细胞过度活化导致毛囊干细胞的数目减少。Smad4基因敲除小鼠中干细胞数目减少导致12月龄基因敲除小鼠的表皮和毛囊角质细胞增殖速度剧烈下降,肥大的表皮、毛囊和皮脂腺逐渐萎缩。毛囊干细胞在创伤后被活化,通过产生短暂增殖性细胞快速向表皮层迁移参与创面的重上皮化。2月龄时Smad4基因敲除小鼠伤口边缘增殖的角质细胞数较对照小鼠明显增多,而到了10月龄Smad4基因敲除小鼠伤口增殖的角质细胞数较2月龄基因敲除小鼠显著减少,这也印证了Smad4基因敲除小鼠中毛囊干细胞过度活化最终导致数目减少的观点。许多证据显示皮肤肿瘤的发生与毛囊干细胞的关系密切。本研究中我们发现Smad4基因敲除小鼠导致毛囊干细胞过度活化,使增殖性细胞增多,导致8月龄以前Smad4基因敲除小鼠肿瘤的发生;然而毛囊干细胞以自我更新为代价,分裂产生过多的短暂增殖性细胞使干细胞数目减少,随着短暂增殖性细胞的消耗,8月龄以后Smad4基因敲除小鼠几乎没有肿瘤发生。毛囊干细胞有分化成为多种子代细胞类型的潜能,例如表皮、毛囊和皮脂腺细胞,因而毛囊干细胞来源的肿瘤也表现出多样性。与此相一致的是Smad4基因敲除小鼠发生多种类型的皮肤肿瘤包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、乳头瘤和皮脂腺瘤。我们的实验结果证明Smad4基因敲除通过使毛囊干细胞过度活化从而导致了皮肤肿瘤的发生。Smad4基因敲除小鼠中活化型的β-catenin信号明显增强与干细胞的过度活化相关,而Pten的表达、Akt和GSK-3β磷酸化水平并没有改变,说明β-catenin活化并不依赖于PI3K/Akt信号的过度激活。Smad4基因敲除导致c-Myc表达明显升高,α6-integrin的表达降低,有可能通过改变毛囊干细胞的微环境,减弱了干细胞对其壁龛的黏附,使干细胞的自我更新异常,由通过不对称分裂产生一个干细胞和一个短暂增殖性细胞转变为分化为2个短暂增殖性细胞,促使毛囊干细胞过多的分化成为短暂增殖性细胞。综上所述,我们首次揭示了Smad4基因敲除引起毛囊干细胞过度活化,证明Smad4基因在维持毛囊干细胞正常自我更新中发挥非常重要的作用。