家蚕Sericin-1启动子组织专一性相关功能序列的分析

论文摘要

家蚕（Silkworm）是最早人工饲育的经济昆虫之一。几千年来,家蚕因为其强大的合成和分泌丝蛋白（丝素和丝胶）能力而备受人类关注。丝腺是合成和分泌丝蛋白的特殊器官,从形态和功能上可以分为三部分:前部丝腺（ASG）、中部丝腺（MSG）和后部丝腺（PSG）。丝蛋白的大量合成和分泌是在五龄起第3日开始的,后部丝腺特异性的合成和分泌丝素蛋白,而中部丝腺特异性地合成和分泌丝胶蛋白。两种丝蛋白基因的时间特异性和组织特异性表达现象,引起了研究者们广泛的兴趣。基因表达受多种调控因子的多级调节,其中启动子的调控占有十分重要的地位。因此,研究丝蛋白基因启动子的功能序列对于深入了解基因的表达调控机制具有十分重要的意义。 目前已有5种丝胶基因被克隆和分离,分别被称为Ser1、Ser2、MSGS3、MSGS4和MSGS5,其中Ser1基因是丝胶蛋白的主要表达基因。Guo XY等将EGFP报告基因连接在1.6 Kbp长的Ser1基因启动子序列及信号肽序列下游,构建含上述表达框的重组杆状病毒（Acserpegfp △EGT）。五龄起蚕时,将Acserpegfp △EGT注射入家蚕体腔,通过荧光解剖显微镜观察发现:报告基因EGFP能够丝腺特异性地分泌表达。然而,Ser1基因这种组织特异性表达现象的内在机理还很不清楚。 本研究利用AcMNPV介导的体内瞬时表达方法,对Ser1基因的启动子序列进行部分删除,通过分析EGFP报告基因的表达,研究Ser1启动子序列中与丝腺组织专一性表达相关的元件。首先,对Ser1基因全长启动子进行了5’端分段顺次缺失,用PCR方法构建得到6种不同长度的Ser1启动子序列。将这6种Ser1启动子序列分别与报告基因EGFP连接构建表达盒,分别装入转移载体pFFa2中,成功获得6种重组的转移载体:pFFa2-1.2serEGFP,pFFa2-0.92serEGFP,pFFa2-0.64serEGFP,pFFa2-0.43serEGFP,pFFa2-0.27serEGFP和pFFa2-0.18serEGFP。通过Bac-to-Bac系统制备6种重组杆状病毒Ac1.2serEGFP、Ac0.92serEGFP、Ac0.64serEGFP、Ac0.43serEGFP、Ac0.27serEGFP和Ac0.18serEGFP。这些重组病毒分别经注射感染五龄起家蚕,通过荧光显微镜观测蚕组织中EGFP基因的表

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 第一章 文献综述
• 1.1 家蚕丝腺的结构和功能
• 1.1.1 后部丝腺
• 1.1.2 中部丝腺
• 1.1.3 前部丝腺
• 1.1.4 菲氏腺
• 1.2 蚕丝蛋白及其结构
• 1.2.1 丝素蛋白
• 1.2.1.1 丝素重链蛋白
• 1.2.1.2 丝素轻链蛋白和P25蛋白
• 1.2.2 丝胶蛋白
• 1.3 丝蛋白基因的调控研究进展
• 1.3.1 基因表达调控的相关研究
• 1.3.2.1 顺式作用调控
• 1.3.2.2 反式作用调节
• 1.3.2.3 其它
• 1.3.2 家蚕丝蛋白基因调控的研究方法体系
• 1.3.2.1 体外研究方法
• 1.3.2.2 瞬时表达系统
• 1.3.2.3 转基因体系
• 1.3.2.4 利用果蝇系统研究来家蚕基因的方法
• 1.3.2.5 Bac-to-Bac系统介导的体内瞬时表达研究
• 1.3.3 丝蛋白基因的调控研究进展
• 1.3.3.1 丝胶1基因的调控研究进展
• 1.3.3.2 其它几种丝胶基因的调控研究
• 1.3.3.3 丝素蛋白基因的调控研究
• 1.4 开展丝腺研究的意义
• 第二部分 研究内容
• 第二章 前言
• 2.1 研究的背景及意义
• 2.2 技术路线
• 第三章 5’端单侧缺失分析Ser1启动子的丝腺表达特异性相关区间
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 质粒和菌株
• 3.2.1.2 家蚕
• 3.2.1.3 试验材料
• 3.2.1.4 细菌培养及质粒抽提溶液
• 3.2.1.5 主要仪器
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 设计分段缺失Ser1启动子的引物
• 3.2.2.2 PCR扩增6种5'端缺失的Ser1启动子
• 3.2.2.3 PCR产物的纯化
• 3.2.2.4 PFFa2-1.6serEGFP质粒和PCR产物的酶切、纯化
• 3.2.2.5 连接反应
• 3.2.2.6 转化
• 3.2.2.7 质粒 DNA的小量制备
• 3.2.2.8 6种重组转移载体质粒的鉴定
• 3.2.2.9 供体质粒转化DH10Bac△EGT细菌
• 3.2.2.10 重组病毒基因组DNA（Bacmid）的分离
• 3.2.2.11 重组Bacmid的PCR鉴定
• 3.2.2.12 重组 AcMNPV病毒的制备
• 3.2.2.13 病毒的大量扩增、纯化、保存及滴度测定
• 3.2.2.14 EGFP在家蚕组织的表达观察
• 3.3 结果
• 3.3.1 6种不同长度5’端缺失的Ser1启动子的PCR结果
• 3.3.2 Ser1启动子5’端缺失的6种重组转移载体的构建
• 3.3.3 6种重组转移载体质粒的鉴定
• 3.3.4 Ser1启动子5’端缺失的六种Bacmid鉴定
• 3.3.5 6种重组病毒的扩增及纯化结果
• 3.3.6 EGFP在家蚕体内的表达观察结果
• 3.4 讨论
• 第四章 丝腺特异性表达相关功能序列的体内研究
• 4.1 引言
• 4.2 设计思路
• 4.3 研究内容
• 4.3.1 设计引物
• 4.3.2 制备6种部分删除的Ser1启动子片段
• 4.3.2.1 △1ABSer片段的扩增
• 4.3.2.2 △2ABSer～△6ABSer片段的扩增
• 4.3.3 6种重组转移载体的构建
• 4.3.4 重组病毒的构建和扩增
• 4.3.5 部分删除Ser1启动子在蚕体内组织的表达观测
• 4.4 讨论
• 第五章 与Ser1基因丝腺特异性表达相关的转录因子分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.1.1 核蛋白抽提过程中的试剂
• 5.2.1.2 Bradford测定蛋白浓度中的试剂
• 5.2.1.3 探针标记中所需的试剂
• 5.2.1.4 EMSA过程中所需的试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 中部丝腺及脂肪体核蛋白抽提
• 5.2.3.2 Bradford方法测定核抽提物蛋白浓度
• 5.2.3.3 探针标记与纯化
• 5.2.3.4 凝胶迁移阻滞实验
• 5.3 结果
• 5.3.1 探针的标记结果
• 5.3.2 中部丝腺和脂肪体核抽提物的制备结果
• 5.3.3 探针与两种核抽提物的结合及竞争实验结果
• 5.4 讨论
• 第三部分 总结与展望
• 第六章 总结与展望
• 6.1 结论与主要创新点
• 6.2 展望
• 参考文献
• 第四部分 附录
• 附录1: 博士期间参与的课题研究
• 附录2: 博士期间相关论文发表情况
• 致谢
• 独创性声明