人类锌指蛋白家族新基因ZNF641和突触小泡蛋白类似新基因hSVOP的克隆与功能研究

论文摘要

转录因子在多种细胞功能中担任了重要角色,包括细胞生长、增殖、调亡和细胞内的信号转导。人们已经鉴定了几个大的转录因子家族。在哺乳动物中,锌指蛋白是最庞大的家族。研究表明,锌指因子能调节多种在心脏表达的基因。为了研究与心脏发育和心脏疾病相关的基因,我们从人类胚胎心脏cDNA文库中分离并鉴定了一个新的锌指基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF641。ZNF641定位在染色体12q13.11区带,含一个KRAB-A框和5个C2H2型锌指。其cDNA全长4906个碱基,含一个1317碱基的开放阅读框,编码一个由438个氨基酸组成,分子量为49.5 kDa的蛋白。Northern杂交分析表明ZNF641在成人组织中广泛表达,其中,在骨骼肌组织有高度表达,在心脏、肝脏和胰腺中有中度表达,在大脑,肾脏和肺中没有表达。通过构建增强型绿色荧光蛋白与ZNF641融合基因的真核表达载体,转染COS-7细胞系,瞬时表达后用荧光显微镜观察ZNF641融合蛋白的活细胞定位及表达,证明ZNF641蛋白在细胞核和细胞质中均有表达。报告基因分析证明ZNF641是一个转录激活因子,结构域分段分析表明ZNF641的KRAB-A框和C2H2锌指之间的连接部分（linker）是其转录激活的关键序列,可能是一个新的转录激活子。ZNF641在COS-7细胞中过表达能激活转录因子AP-1与SRE的活性,这两种因子是MAPK信号途径介导的重要因子,说明ZNF641蛋白可能在MAPK信号途径中作为激活因子介导细胞功能。综合该基因的结构和表达特征,我们初步得出结论认为:ZNF641是参与多种人类胚胎器官发生

论文目录

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• 前言
• 第一章 锌指蛋白与心脏发育研究
• 1.1 锌指蛋白基因家族的概念和分类
• 1.2 锌指蛋白基因的结构和功能
• 1.3 锌指蛋白基因与心脏发育的关系
• 1.4 锌指基因研究展望
• 第二章 ZNF641基因的克隆、序列特征、组织的表达分析及其功能研究
• 2.1 生物信息学软件
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要实验仪器
• 2.3 ZNF641基因的全长克隆
• 2.3.1 引物设计与合成
• 2.3.2 用巢式 PCR反应从人类心脏 cDNA文库中分离ZNF641
• 2.3.3 凝胶回收
• 2.3.4 连接实验
• 2.3.5 感受态细胞的制备
• 2.3.6 连接产物的转化
• 2.3.7 重组克隆的筛选和鉴定
• 2.3.8 质粒酶切
• 2.3.9 ZNF6415’RACE和3’RACE的扩增
• 2.4 ZNF641基因的序列特征分析结果
• 2.4.1 ZNF641的全长 cDNA序列及蛋白质序列特征分析
• 2.4.2 ZNF641其同源基因的编码蛋白的同源性比较及进化分析
• 2.5 ZNF641基因的Northern表达分析
• 2.5.1 Northern膜的制备
• 2.5.2 Northern杂交
• 2.5.3 Northern表达结果分析
• 2.6 ZNF641基因在亚细胞结构中的定位分析
• 2.6.1 PEGFP-N1-ZNF641重组质粒构建
• 2.6.2 细胞培养及转染
• 2.6.3 EGFP-N1-ZNF641融合蛋白的亚细胞定位结果分析
• 2.7 ZNF641基因的初步功能研究
• 2.7.1 ZNF641的表达报告基因检测
• 2.7.1.1 质粒构建
• 2.7.2.2 表达报告基因检测
• 2.7.2 ZNF641结构域分段研究
• 2.7.2.1 ZNF641结构域片段质粒构建
• 2.7.2.2 ZNF641基因的结构域片段报告基因表达检测
• 2.7.3 实验结果的讨论
• 第三章 hSVOP基因的克隆表达分析及其功能研究
• 3.1 hSVOP基因的克隆
• 3.2 hSVOP基因的全长cDNA序列结果分析
• 3.3 hSVOP的分子特征和进化树分析
• 3.4 hSVOP基因的Northern杂交和组织特异性表达
• 3.5 hSVOP基因的亚细胞定位结果分析
• 3.5.1 EGFP-N1-hSVOP重组质粒构建
• 3.5.2 亚细胞定位分析
• 3.6 实验结果的讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1
• 附录2