微生物酶法合成左乙拉西坦手性中间体的研究

论文摘要

左乙拉西坦是一种手性抗癫痫特效药物,因其显著的疗效、较高的安全性以及在新药研发方面的巨大潜在价值,而广受关注。在左乙拉西坦合成过中,（S）-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯是关键的手性中间体。本论文从土壤中筛选得到了一株对外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯具有较好立体选择性水解活性的菌株,经16SrDNA测序,初步鉴定为蜡状芽孢杆菌,并命名为蜡状芽孢杆菌WZZ001 （Bacillus cereus WZZ001）,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为：CCTCCM 2012403 。通过脂肪酶盖子结构实验的验证,菌株B. cereus WZZ001所产的酯类水解酶为脂肪酶。本论文对菌株B. cereus WZZ001发酵产酶条件进行了初步优化,最适产酶培养基组成为：麦芽糖5g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏1 g/L,MgSO4 5mmol/L。将菌株B. cereus WZZ001接种于最适产酶培养基,在30 L通风式发酵罐中,30℃培养24 h。酶的活力达到163.59 U/L,生物量为7.29 g/L论文对菌株B. WZZ001静息细胞催化外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的不对称水解反应进行了优化研究。确定了最优的酶转化条件：静息细胞添加量2%,底物浓度2%,反应温度37.5℃,pH7.8,反应时间13 h。在上述酶催化反应条件下,转化率54.04%,e.e.s值达到99.9%以上,对映选择率E为168.14。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 癫痫及其治疗药物概述
• 1.1.1 癫痫病症简述
• 1.1.2 抗癫痫药物简介
• 1.2 左乙拉西坦的研究进展
• 1.2.1 左乙拉西坦简介
• 1.2.2 左乙拉西坦的合成途径
• 1.3 左乙拉西坦中间体的合成
• 1.3.1 2-溴丁酸甲酯的合成
• 1.3.2 （R）-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸甲酯的合成
• 1.3.3 （S）-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸的合成
• 1.4 本论文的研究思路
• 1.4.1 研究意义及背景
• 1.4.2 研究思路及内容
• 第二章 高立体选择性脂肪酶筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的合成
• 2.2.2.2 菌种初筛
• 2.2.2.3 菌种复筛
• 2.2.2.4 实验分析方法
• 2.2.2.5 α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸衍生化方法
• 2.2.2.6 脂肪酶盖子结构的验证实验
• 2.2.2.7 数据处理方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的合成
• 2.3.2 气相色谱检测标准曲线的建立
• 2.3.3 产酶菌种筛选结果
• 2.3.4 外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸水解剩余底物及产物衍生化检测结果
• 2.3.5 菌种鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 B.cereus WZZ001产酶发酵条件的优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 培养基
• 3.2.1.2 实验菌种
• 3.2.1.3 主要仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 B.cereus WZZ001发酵条件
• 3.2.2.2 生物量测定方法
• 3.2.2.3 对映体过量值及转化率测定
• 3.2.2.4 酶活力测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 最适氮源
• 3.3.2 最适碳源
• 3.3.3 金属离子的影响
• 3.3.4 最适初始pH确定
• 3.3.5 B.cereus WZZ001生长及产酶曲线
• 3.4 本章小结
• 第四章 B.cereus WZZ001不对称水解α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯条件的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.0 B.cereus WZZ001静息细胞的制备方法
• 4.2.2.1 B.cereus WZZ001不对称水解α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的基本方法
• 4.2.2.2 （R）-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的消旋化方法
• 4.2.2.3 水/有机溶剂两相酶催化反应体系的实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 反应体系pH的影响
• 4.3.2 反应温度的影响
• 4.3.3 中和剂类型的影响
• 4.3.4 底物浓度的影响
• 4.3.5 B.cereus WZZ001静息细胞重复利用实验结果
• 4.3.6 （R）-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸消旋化实验结果
• 4.3.7 水/有机溶剂两相酶催化反应体系的实验结果
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢