miR-371调节肝癌细胞QGY-7703的细胞周期

论文摘要

目的:微小RNA（microRNA,miRNA）是一类非编码调控单链小分子RNA,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合对靶基因进行转录后水平调控而参与多种生理和病理过程,如细胞的生长、发育、分化、凋亡以及肿瘤的发生和发展等。本实验室前期研究已证实肝癌细胞生长与miR-373有直接的联系,而miR-371、-372、-373是一个同时转录的基因簇,因此本项目中我们拟深入研究miR-371与肝癌细胞生长的关系,并寻找其直接作用的靶基因,分析其发挥作用的分子机制为进一步阐明miR-371在肝癌发生和发展过程中发挥作用的分子机制提供了新的理论依据。方法:首先利用实时定量PCR方法检测miR-371在人肝癌组织和癌旁正常组织中的差异表达,并在人肝癌细胞系QGY-7703中过表达或者封闭miR-371,在实时定量PCR确定其表达变化的基础上,利用MTT实验、集落形成实验、生长曲线实验分别检测miR-371对QGY-7703细胞生长活性和增殖能力生长的影响,流式细胞术（FACS）检测细胞周期的变化。在确认miR-371与细胞周期相关之后,我们通过生物信息学方法预测其靶基因,从中挑选了与细胞周期过程密切相关的靶基因PRPF4B为研究对象,并利用荧光报告载体实验验证miR-371对靶基因的直接调控作用,利用实时定量PCR和Western blot实验技术检测miR-371水平不同的QGY-7703细胞或组织标本中靶基因mRNA和蛋白水平的变化,从而进一步验证miR-371对靶基因的调控方式。而后利用RNA干扰技术敲除该靶基因后,通过MTT实验、集落形成实验、生长曲线以及流式细胞术进一步研究了该靶基因的功能。最后我们构建了过表达靶基因的质粒（此质粒不含3’UTR）,将其转染进QGY-7703细胞中,通过检测细胞表型及细胞周期的改变,从而进一步阐明miR-371对靶基因的调控。结果:实时定量PCR结果显示,miR-371在人肝癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。在肝癌细胞中封闭miR-371后,细胞生长速度减慢;过表达miR-371则加速了细胞的生长。流式细胞术检测发现封闭miR-371后,细胞周期进程减慢,而G1期比例增加,S期比例相应的减少。靶基因筛选得到PRPF4B为miR-371的候选靶基因,其3’非翻译区包含miR-371的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实,miR-371能够通过作用于靶基因3’非翻译区的特定位点,对其表达在转录后进行负性调节。而在miR-371表达增加的肝癌细胞或组织中,靶基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显降低。在肝癌细胞QGY-7703中,敲除靶基因PRPF4B后,细胞的增殖能力增强,相反,当把PRPF4B过表达后,QGY-7703细胞的增殖能力减弱,可以挽救miR-371对细胞的表型的影响。结论:在肝癌细胞中,miR-371通过下调靶基因PRPF4B的表达水平促进细胞增殖,起到癌基因的作用。阐明miR-371在QGY-7703细胞中的具体作用及其发挥作用的机制,将有利于我们对肝癌的发生发展的分子机制的理解,同时也为肝癌的诊断和治疗提供新的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、miR-371在肝癌中的作用研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.3 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.3 小结
• 二、miR-371的细胞周期相关靶基因的确定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.3 小结
• 三、靶基因在肝癌中的作用研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 统计学方法
• 3.2 结果
• 3.3 小结
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 miRNA与肿瘤
• 综述参考文献
• 致谢