利用控制硫甙合成基因的InDel标记筛选抗癌花椰菜新种质

论文摘要

本试验以青花菜与花椰菜双单倍体纯系A5、A82的杂交后代与花椰菜连续回交3代的199个群体为供试材料,利用所开发的标记对GSL-ALK和GSL-ELONG 2个基因进行检测。试验结果结果如下:1.开发了GSL-ALK基因的InDel标记ALK-InDel在缺失区域对GSL-ALK基因设计引物,从引物组合中筛选出一个组合Odd2f/ALK-3的扩增条带清晰且能分辨出缺失序列差别。测序确认扩增片段为该基因所特有,命名该标记为ALK-InDel。并将该标记在青花菜和花椰菜小群体中进行验证。2.开发了GSL-ELONG基因的InDel标记ELONG-InDel在缺失区域对GSL-ELONG基因设计引物,从引物组合中筛选出2个组合扩增片段大小适合,其中以P12f/P11r组合扩增产物强且无非特异条带,初步确定P12f/P11r为此试验中的引物组合。在测序的基础上设计引物进行二次筛选,P11/P15组合扩增效果最好、没有非特异带且扩增片段相对较小,容易检测出碱基的差异。对PCR产物测序确认扩增片段为该基因所特有。命名该标记为ELONG-InDel。并将该标记在青花菜和花椰菜小群体中进行验证。3.GSL-ALK基因PCR体系优化本试验对GSL-ALK基因PCR扩增中dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度等进行了优化。结果表明:在20ul的体系中10mmol/L dNTPs的量为0.2 uL、5umol/L引物的量为0.6 uL、5U/uL Taq酶的用量为0.1uL、模板DNA用量为30ng时扩增效果最好。4.在回交群体材料中对GSL-ALK-基因进行检测本试验在199个混合群体中检测出GSL-ALK-基因的群体数为56个,表明通过传统转育手段也可获得较高的转育率。对群体单株提取DNA共3889份,检测出1281个单株。5.对确认后材料GSL-ELONG+基因进行检测在56个群体中检测出GSL-ALK-/ GSL-ELONG+的群体有4个,从中选择出16个单株。筛选出基因型为ALK-/ ELONG-的群体数为6个。6.对GSL-ALK+基因材料进行GSL-ELONG+进行检测检测出GSL-ALK+/ GSL-ELONG+的群体数有3个,选择出22个单株的基因型为GSL-ALK+/ GSL-ELONG+。7.通过本试验的研究,发现标记这两个基因在植株的整个生育期都可以进行,不受外界条件的影响。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 癌症现状
• 1.2 十字花科蔬菜的抗癌研究情况
• 1.2.1 十字花科蔬菜的抗癌研究
• 1.2.2 十字花科蔬菜的抗癌机理
• 1.2.3 十字花科蔬菜的抗癌特性
• 1.2.4 十字花科蔬菜的抗癌过程
• 1.2.4.1 PhaseⅡ酶基因的转录
• 1.2.4.2 PhaseⅡ酶作用于机体自身的抗癌系统
• 1.3 分子标记类型及特点
• 1.3.1 分子标记的类型
• 1.3.1.1 以PCR 技术为基础
• 1.3.1.2 以重复序列为基础
• 1.3.1.3 单链构象多态标记
• 1.3.1.4 以southern 杂交技术为基础
• 1.3.1.5 原位杂交技术
• 1.3.1.6 几种新型分子标记
• 1.3.2 InDel 标记
• 2 前言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.2 试剂与仪器
• 3.2.1 试验试剂
• 3.2.2 试验场所及主要试验仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 试验流程
• 3.3.2 PCR 引物设计
• 3.3.2.1 引物设计
• 3.3.2.2 植物基因组DNA 的提取和检测
• 3.3.2.3 测序与序列分析
• 3.3.2.4 PCR 产物纯化与克隆
• 3.4 PCR 扩增反应及电泳分析
• 3.4.1 引物开发部分PCR 扩增及检测
• 3.4.2 GSL-ALK 基因PCR 体系优化
• 3.4.3 扩增产物检测
• 3.4.3.1 用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（GSL-ALK）
• 3.4.3.2 GSL-ELONG 基因检测
• 3.5 检测结果的统计
• 3.5.1 GSL-ALK-基因的统计
• +基因的统计'>3.5.2 GSL-ELONG⁺基因的统计
• 4 结果与分析
• 4.1 基因组DNA 的检测
• 4.2 GSL-ALK 的InDel 标记开发
• 4.2.1 GSL-ALK 基因的引物筛选
• 4.2.2 扩增片段的克隆及菌落PCR
• 4.2.3 测序与序列比对
• 4.3 GSL-ELONG 基因的InDel 标记开发
• 4.3.1 GSL-ELONG 基因的引物初步筛选
• 4.3.2 测序与序列比对
• 4.4 GSL-ALK 基因PCR 体系优化
• 4.4.1 不同dNTPs 量对PCR 产物的影响
• 4.4.2 不同引物量对PCR 扩增效果的影响
• 4.4.3 Taq 酶对PCR 扩增效果的影响
• 4.4.4 模板DNA 对PCR 扩增效果的影响
• 4.5 对GSL-ALK 基因的检测
• 4.5.1 在回交群体材料中检测GSL-ALK 基因
• 4.5.2 对确定GSL-ALK 基因群体进行单株检测
• 4.5.3 确认后材料GSL-ELONG 基因的检测
• 4.5.3.1 对确定GSL-ALK 基因进行GSL-ELONG 的检测
• +基因材料进行 GSL-ELONG 基因的筛选'>4.5.3.2 对 GSL-ALK⁺基因材料进行 GSL-ELONG 基因的筛选
• 4.6 不同植株生长期对提取DNA 的影响
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 开发了GSL-ALK 基因的InDel 标记ALK-InDel
• 5.1.2 开发了GSL-ELONG 基因的InDel 标记ELONG-InDel
• 5.1.3 GSL-ALK 基因筛选总结果
• 5.1.4 GSL-ELONG 基因筛选总结果
• 5.1.5 GSL-ALK 和GSL-ELONG 的交叉结果
• 5.2 讨论
• 5.2.1 基因组DNA 的提取
• 5.2.2 PCR 扩增
• 5.2.2.1 PCR 体系优化
• 5.2.2.2 PCR 产物检测
• 5.2.3 检测方法
• 5.2.4 GSL-ELONG 基因的扩增
• 5.2.5 植株不同生长期对DNA 提取的影响
• 5.2.6 关于转育
• 参考文献
• ABSTRACT