论文摘要
食管癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,我国是世界上食管癌发生率和死亡率最高的国家,每年约有25万新诊断的病例。原河南省林县（现林州）和河北省磁县是我国食管癌发病最高的地区,发病率超过100/10万。全国第一次恶性肿瘤死亡调查发现,山东省肥城市也是我国食管癌高发区,1970～1974年食管癌死亡率为63.19/10万,仅次于河南林州,给当地居民的生命健康带来严重危害。食管癌是多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病。国内一项移民流行病学研究发现,河南林州居民移居到山西长治100年后,自然人群食管癌检出率仍与林州原居住地居民相似,说明环境和时间变化均未明显影响食管癌的发生率,提示遗传因素在其发生中可能起着重要的作用。已有的研究表明,食管癌的危险因素存在地区和种族等差异,包括营养元素缺乏、个人饮食习惯、生活行为方式（吸烟、饮酒等）和食管癌家族史等。但同样暴露于相同的生活环境,甚至具有相似的生活行为方式,而是否发生肿瘤却因人而异。目前多数学者认为,人群对肿瘤易感性的不同主要与肿瘤相关基因的遗传多态性有关。随着人类基因谱的建立和蛋白质组学的发展,发现蛋白酶的功能是由其相应的基因表达产物所致,而基因某位点的多态性或单体基因图谱的差异,则引起其表达的酶活性改变。另外,基因某位点的突变,可以是先天遗传的、也可以是外界致癌物作用所致。从代谢酶基因、DNA修复基因、癌基因及抑癌基因的遗传多态性入手研究易感基因和癌标志物是目前肿瘤分子流行病学的热点。在基因易感性方面,已报道MTHFR、CYP1A1、CYP2A6、CYP2E1、GSTM1、GSTT1、hOGG1、XRCC1、XPD、p53等基因多态性与食管癌关系的研究,结论尚无一致性,而有关食管癌前病变的基因易感性研究非常罕见;在血清蛋白标志物方面,已报道CEA、CA19-9、SCCA等与食管癌的预后有关联,而与食管癌前病变的关联研究很少;在食管癌组织及癌旁组织蛋白表达方面,已报道p53、CK19、CK20等与食管癌发生发展有关,而未见对癌前病变患者组织的研究;在外周血基因mRNA表达与食管癌关联的研究方面,仅限于食管癌,而对癌前病变的研究未见报道。总之,从上述不同方面研究食管癌的生物标志物较多,涉及食管癌前不同病变阶段的研究却很少。自20世纪70年代以来,病理学和流行病学研究证实,食管上皮粘膜的恶性变是一个多阶段、逐步发展的过程,它包括:正常食管粘膜上皮→基底细胞增生→不典型增生→原位癌→癌;其中,食管粘膜上皮不典型增生被认为是食管癌发生的癌前病变。食管癌高发区的随访研究表明,食管鳞状上皮轻、中度不典型增生（上皮内低级别瘤样变）是一个活跃而不稳定的阶段,大部分病例可逆转,仅有3%～5%的病例经长时间发展而成重度不典型增生（上皮内高级别瘤样变）,重度不典型增生是比较稳定的阶段,逆转的可能性较小,最终发展成癌。因此,早期发现轻、中度不典型增生及对该部分群体进行干预,促使其逆转,对食管癌的防治具有重要意义。碘染色内镜检查是早期检出食管疾病的有效方法,但其具有微创性,代价高,群众接受率较低等缺点。因此,从外周血探讨与食管癌和不典型增生有关联的生物学标志物,将有利于发现无创性的高危人群筛查方法及动态监测其病变转化。由于外周血单个核细胞中基因mRNA表达产物的测定灵敏度远高于外周血清中的相关蛋白表达的测定,所以,以RT-PCR检测某些基因mRNA在外周血单个核细胞中的表达成为研究的热点。过去报道的食管癌危险因素研究主要是以医院为基础的单一病例对照研究,癌症病例为医院就诊者,存在设计差异;食管癌的地区分布差异也很大,导致研究结论不一致。食管癌前病变绝大多数没有临床症状,同时高发社区人群内镜普查代价较大,造成了以食管癌前病变为指示病例的研究非常罕见。如果能以在高发社区人群中检出的食管癌及其癌前病变为指示病例,同时进行食管癌、不典型增生、基底细胞增生和正常对照组的多组病例-对照研究,对探讨食管癌及其癌前病变的危险因素及有关联的生物标志物是非常有学术价值和现实意义的。肥城地区虽为食管癌高发区,但一直未在该地进行过任何的防治研究。我们与肥城市人民医院合作,于2004年1月～2006年12月,在肥城孙伯等6乡镇中对40岁及以上人群进行了9536人的免费碘染色内镜加活检的食管病变普查,建立了食管癌变不同阶段的病例及正常对照的流行病学资料和标本库,为本研究探讨食管癌及其癌前病变的危险因素及有关联的生物标志物提供了有利条件。研究目的本研究利用肥城市1970～2004年食管癌死亡资料分析食管癌死亡变化趋势及特异性;利用2004年1月～2006年12月碘染色内镜普查建立的食管不同病变资源库,以食管粘膜上皮基底细胞增生、不典型增生和癌为指示病例,将传统流行病学和分子流行病学方法相结合,探讨该地区食管癌及其癌前病变的危险因素,研究MTHFR、CYP2E1和hOGG1基因多态性与食管鳞癌衍变阶段的关系,检测外周血SCCA2、hTERT和EYA4 mRNA在食管鳞癌衍变阶段中的表达;旨在探讨肥城食管癌及其癌前病变的危险因素和易感基因,寻找食管癌前病变向恶性转化的生物标志物,为食管癌高危人群的筛选、危险因素监测和食管癌的防治提供科学依据。研究方法1食管癌死亡变化趋势及特异性分析资料来源:肥城市1970～1974年、1985～1989年和1990～1992年食管癌死亡数据资料来源于山东省卫生厅和肿瘤防治研究办公室组织、山东省医科院负责进行的全死因回顾调查;1997～1999年和2000～2004年食管癌死亡数据为我室在肥城市建立的肿瘤死亡登记报告资料。2食管鳞癌衍变阶段的危险因素分析2.1研究对象选取2004年1月～2006年12月在肥城地区进行的40岁及以上农村居民碘染色内镜普查数据库中病理诊断的食管鳞癌84例、不典型增生563例、基底细胞增生260例,分别为3个病例组,碘染色食管粘膜正常7789例为对照组。2.2问卷调查调查内容包括性别、年龄、文化程度、人年均收入等一般情况;食管癌家族史;生活行为方式（吸烟、饮酒等）;饮食习惯（主副食、蔬菜、水果等）;3食管鳞癌衍变阶段的基因多态性分析3.1研究对象研究对象及问卷调查同第二部分,采集每例研究对象4ml肘静脉血,置于高压灭菌的采血管中,内含0.5mlACD抗凝剂,分离白细胞,悬浮于0.5ml TNE缓冲液中,-80℃保存备用。3.2试验方法采用PCR-RFLP法检测四组研究对象中的MTHFR、CYP2E1基因多态性;采用PCR-SSCP法检测hOGG1基因多态性。4外周血SCCA2、hTERT和EYA4 mRNA在食管鳞癌衍变阶段中的表达4.1研究对象研究对象及问卷调查同第二部分。该组研究对象包括食管鳞癌、不典型增生、基底细胞增生和正常对照各50例。采集每例研究对象4ml肘静脉血,按RT-PCR方法要求,置于经0.1%DEPC水浸泡处理的高压灭菌的采血管中,内含0.5mlACD抗凝剂,-80℃保存备用。4.2试验方法采用RT-PCR检测SCCA2、hTERT和EYA4 mRNA在四组研究对象外周血中的表达。5统计学分析食管癌死亡率变化趋势分析采用负二项回归的方法,观察指标为相对危险度（RR）及其95%可信限（95%CI）;χ2检验用于比较人口学特征、吸烟指数、饮酒指数和食管癌家族史在食管粘膜上皮基底细胞增生、不典型增生、鳞状细胞癌和正常组之间的分布;以食管粘膜上皮基底细胞增生、不典型增生和癌为指示病例组,粘膜上皮正常为对照组,采用多项式Logistic回归分析与食管不同病变有关的危险因素、易感基因型以及基因-环境因素结合的关联度,分析SCCA2、EYA4和HTERT mRNA表达与食管不同病变的关联度,观察指标为比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI）;计算SCCA2 mRNA表达检测食管鳞癌衍变阶段病变的灵敏度和特异度。所有数据分析采用Stata8.0软件和SPSS11.5软件完成。研究结果1食管癌死亡变化趋势及特异性分肥城市1970～2004年男性食管癌标化死亡率均高于女性,期间不同时期的男女性别比为2.16～2067:1。性别比明显高于河南林州,表明该地区食管癌病因具有特异性。负二项回归分析显示,该地食管癌死亡与年龄和性别有关,食管癌死亡率随着年龄组的增高而增高,每相邻两年龄组的RR（下一年龄组食管癌死亡危险是上一年龄组的倍数）值为1.67（95%CI∶1.56～1.78）;男性食管癌死亡危险是女性的2.38倍（95%CI∶1.78～3.18）;而时期和出生队列与食管癌死亡率的变化无关联。2食管鳞癌衍变阶段危险因素分析采用多项式Logistic回归模型进行食管不同病变的危险因素分析,以正常对照组为比较的基线组（OR=1.0）,调整性别、年龄、文化水平和年人均收入（元）后,结果显示:（1）饮酒指数≥130在基底细胞增生、不典型增生和癌组的OR（95%CI）值分别为1.78（1.22～2.59）、1.46（1.13～1.90）和1.44（0.79～2.63）,在癌组未达到显著性水平;（2）吸烟指数≥600在基底细胞增生和癌组达到显著性水平,OR（95%CI）值分别为2.45（1.61～3.73）和2.52（1.14～4.44）,在不典型增生组未达到显著性水平,OR（95%CI）值为1.16（0.87～1.55）;（3）一级亲属有食管癌家族史者在癌组和不典型增生组的OR（95%CI）值分别为2.26（0.29～3.96）和2.11（1.68～2.51）,均达显著性水平,在基底细胞增生组中OR（95%CI）值为1.19（0.81～1.75）,未达到显著性水平;（4）随着食物纤维素摄入量增加减低食管癌的危险性,OR值达到显著性水平;对于基底细胞增生和不典型增生未达到显著性水平;（5）随着食物维生素C摄入量增加趋向减低食管癌的危险性,达到显著性水平;对于基底细胞增生和不典型增生未达到显著性水平;（6）随着蛋白质摄入量增加,趋向减低食管癌、不典型增生和基底细胞增生的危险性,但OR值均未达到显著性水平。而20世纪70年代林州市食管癌的主要危险因素为营养元素缺乏,未发现吸烟和饮酒与食管癌有关联;随着经济条件改善,近年林州市食管癌的资料分析显示饮酒等成为新的危险因素。3食管鳞癌衍变阶段的基因多态性分析3.1 MTHFR基因多态性与食管鳞癌衍变阶段的关联分析本组共检测483例标本,其中食管癌组79例,不典型增生组106例,基底细胞增生组184例,正常对照组114例。MTHFR677位点基因型C/C、C/T、T/T在各组中分布存在统计学差异（χ2=23.527,P=0.001）。以C/C型作为比较基线,C/T和T/T合并后与其比较,调整年龄、文化水平、人年均收入和烟指数后,OR（95%CI）在基底细胞增生和不典型增生组中达到显著性水平,分别为0.32（0.06～0.63）和0.25（0.12～0.51）;OR（95%CI）在食管癌组中为0.82（0.33～2.05）。以不吸烟/不饮酒+C/C基因型作为比较的基线（OR=1.0）,发现将C/T和T/T基因型合并后与吸烟/饮酒与否进行联合分析,在不典型增生组中显示吸烟、饮酒与C/T和T/T基因型有负交互作用,OR（95%CI）分别为0.20（0.07～0.57）和0.21（0.07～0.60）,达到显著性水平。3.2 CYP2E1基因多态性与食管鳞癌衍变阶段的关联分析本组共检测263例标本,其中食管癌组27例,不典型增生组61例,基底细胞增生组131例,正常对照组44例。CYP2E1基因型在各组中分布未见统计学差异（χ2=4.654,P=0.589）;C1/C2结合C2/C2基因型与C1/C1型比较,食管癌、不典型增生和基底细胞增生组的OR（95%CI）值分别为0.87（0.29～2.58）、0.79（0.32～1.96）和1.07（0.50～2.32）;与吸烟、饮酒的联合分析未见交互作用存在。3.3 hOGG1基因多态性与食管鳞癌衍变阶段的关联分析本组共检测289例标本,其中食管癌组34例,不典型增生组69例,基底细胞增生组138例,正常对照组48例。hOGG1基因型在各组中分布未见统计学差异（χ2=6.592,P=0.360）;C/G结合G/G基因型与C/C型比较,食管癌、不典型增生和基底细胞增生组的OR（95%CI）值分别为1.07（0.43～2.68）、1.61（0.72～3.58）和1.05（0.53～2.07）;与吸烟、饮酒的联合分析未见交互作用存在。4外周血SCCA2、hTERT和EYA4 BRNA在食管鳞癌衍变阶段中的表达4.1外周血SCCA2 mRHA表达与食管鳞癌衍变阶段的关联分析以SCCA2mRNA/β-actin表达强度≥0.4作为阳性截断值,外周血SCCA2 mRNA在基底细胞增生组、不典型增生组、食管鳞癌组和正常对照组中的阳性表达率分别为48%（24/50）、60%（30/50）、82%（41/50）和36%（18/50）,各组间存在统计学差异（χ2=23.497,P=0.000）,其中,食管鳞癌组与其他三组比较有显著性差异（P＜0.05）,不典型增生组与对照组比较有显著性差异（χ2=5.769,P=0.016）。多项式logistic回归分析结果显示,调整年龄、性别、吸烟指数、饮酒指数和食管癌家族史后,SCCA2的OR（95%CI）在基底细胞增生组、不典型增生组和癌组分别为1.71（0.73～3.99）、2.77（1.14～6.71）和7.87（2.88～21.55）;以SCCA2/β-actin表达强度≥0.4作为阳性截断值时,检测灵敏度在基底细胞增生组、不典型增生组和癌组中分别为48%、60%和82%,特异度均为64%。4.2外周血hTERT mRNA表达与食管鳞癌衍变阶段的关联分析以hTERT/β-actin表达强度≥0.4作为阳性截断值,外周血hTERT mRNA在食管鳞癌组、不典型增生组、基底细胞增生组和正常组中的阳性表达率分别为90%（45/50）、84%（42/50）、80%（40/50）和80%（40/50）,各组间比较无统计学差异,（χ2=2.432,P=0.488）;多项式logistic回归分析结果显示,调整年龄、性别、吸烟指数、饮酒指数和食管癌家族史后,hTERT的OR（95%CI）在基底细胞增生组、不典型增生组和癌组均未达到显著性水平,分别为1.36（0.47～3.96）、1.41（0.45～4.44）和2.87（0.78～10.60）。4.3外周血EYA4 mRNA表达与食管鳞癌衍变阶段的关联分析以EYA4/β-actin表达强度≥0.4作为阳性截断值,外周血EYA4 mRNA在食管鳞癌组、不典型增生组、基底细胞增生组和正常组中的阳性表达率分别为10%（5/50）、4%（2/50）、4%（2/50）和4%（2/50）,各组间比较无统计学差异（χ2=2.597,P=0.458）。多项式logistic回归分析结果显示,调整年龄、性别、吸烟指数、饮酒指数和食管癌家族史后,EYA4的OR（95%CI）在基底细胞增生组、不典型增生组和癌组均未达到显著性水平,分别为1.35（0.17～10.80）、1.29（0.15～11.10）和4.22（0.63～28.33）。结论1肥城市近30多年来食管癌死亡率变化呈前期平稳上升而近期略微下降的趋势,可能与该地固定的生活模式和/或遗传因素有关;食管癌死亡性别比明显高于河南林州,表明该地食管癌发生有其自身特异性。2影响肥城地区食管癌发生的主要危险因素为一级亲属有食管癌家族史、吸烟、食物纤维素和维生素C缺乏;不典型增生的危险因素为一级亲属有食管癌家族史和饮酒;基底细胞增生的危险因素为吸烟和饮酒。3 MTHFR677位点C/T和T/T基因型与食管癌发生无关,与食管粘膜不典型增生和基底细胞增生有关联,在其发生中起保护作用,该二基因型可降低吸烟者或饮酒者发生不典型增生的危险性。未见CYP2E1基因多态和hOGG1基因多态与食管癌衍变不同阶段病变有关联。4外周血中SCCA2 mRNA表达与食管鳞癌衍变阶段有关,hTERT和EYA4mRNA表达与食管鳞癌衍变阶段无关,结果提示外周血SCCA2 mRNA表达水平的变化有望用于食管癌前病变的动态监测中,但尚不能对食管中、重度不典型增生的治疗提供辅助诊断的依据。创新点与意义1本研究利用食管癌高发社区碘染色内镜加病理活检建立的流行病学调查数据和生物标本库,以普查诊断的食管鳞癌衍变阶段病变及正常者为研究对象,按照多组病例与一组对照的病例-对照研究设计,采用多项式Logistic回归分析食管鳞癌衍变各阶段的危险因素、易感基因和外周血中基因mRNA的表达。该研究设计与以医院为基础的或单一的病例-对照研究不同,更具有科学性。2本研究通过对食管癌死亡监测资料和食管鳞癌衍变不同阶段病变的危险因素分析,并与河南林州市资料进行对比,发现了该地区食管癌危险因素的特异性,为该地区食管癌的防治提供科学依据。3本研究对食管鳞癌衍变不同阶段病变同时进行多个易感基因和基因mRNA表达的探讨,为进一步研究与食管癌和不典型增生有关联的生物标志物和以此监测食管癌前病变向恶性转化提供了基础。不足与改进不足:1各基因仅检测了一个多态性位点,不能进行单体基因图谱与疾病的关联分析;2基因多态性的检测样本例数少,限制了基因-基因间的交互作用分析。改进:1加大样本量进行基因多位点多态性分析,进行单体基因图谱与食管癌变不同阶段的关系研究;2利用本研究发现的生物标志物动态监测食管癌前病变的衍变状态,继续探索新的生物标志物,为食管癌前病变的治疗提供辅助诊断依据。