草甘膦对烟草超微结构的影响及烟草EPSPS Ⅰ基因克隆

论文摘要

5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvlyshikimate-3-phyosphate synthase,简称EPSPS）是由EPSPS基因编码的、存在于植物及细菌真菌莽草酸途径中的一种关键酶,它能催化植物及细菌真菌体内5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸（5-enolpyruvlyshikimate-3-phyosphate,简称EPSP）的生物合成,进而形成一些生命活动的重要代谢中间产物。草甘膦是农业生产中应用广泛的非选择性除草剂,它专一性抑制EPSPS活性,从而影响磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol-pyruvate,简称PEP）与莽草酸-3-磷酸（shikimate-3-phyosphate,,简称S3P）结合生成植物及细菌真菌生长所需EPSP,阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成。EPSPS对草甘膦抗性的获得可通过EPSPS基因过量表达、EPSPS基因点突变降低EPSPS对草甘膦的活性以及引入解毒酶基因。本文主要进行了3个方面的研究:第一,研究了草甘膦对烟草叶片超微结构的影响,进一步探讨草甘膦与EPSPS的作用机制;第二,克隆了烟草EPSPSⅠ基因CDS序列;第三,优化了烟草愈伤组织培养体系,所获结果如下:1、用30 mmol/L草甘膦处理烟草叶片2h、6h、12h、24h和48h后,分别取样和拍照,与对照进行比较,结果显示处理12h内烟草叶片外表无明显变化;24和48h后叶片黄化,并出现坏死。对各处理时期烟草叶片超微结构研究显示,草甘膦处理导致烟草叶片细胞叶绿体基粒片层结构被破坏;线粒体电子密度下降。这些结果提示草甘膦通过阻碍植物的光合作用和呼吸作用,导致叶片坏死。2、克隆了EPSPSⅠ基因CDS全长序列,下一步将进行测序与转化。3、优化了烟草愈伤组织的培养诱导体系,结果显示,选用叶片作为外植体可以迅速获得大量愈伤组织。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 除草剂草甘膦的特点
• 1.2 EPSPS的来源与作用机理
• 1.3 草甘膦的作用机制
• 1.4 草甘膦的生物降解机制
• 1.5 抗革甘膦植物的获得途径
• 1.6 研究存在的问题
• 1.7 选育抗草甘膦作物的发展前景
• 1.8 植物组织培养的研究概况
• 1.8.1 植物组织培养的发展简史
• 1.8.2 组织培养的应用领域
• 1.8.3 组织培养存在的问题
• 1.9 电子显微镜技术的发展趋势与应用特点
• 1.9.1 显微镜的发展简史
• 1.9.2 发展趋势与应用领域
• 1.9.3 生物显微镜的研究热点
• 1.10 本论文研究的内容与意义
• 1.10.1 研究内容
• 1.10.2 研究目标
• 2 草甘膦处理对烟草叶片超微结构的影响
• 2.1 植物材料
• 2.2 样品制备
• 2.3 超薄切片
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 草甘膦处理后烟草表型变化
• 2.4.2 草甘膦处理后烟草叶超微结构的变化
• 2.5 讨论
• 3 烟草EPSPS Ⅰ基因的克隆
• 3.1 植物材料
• 3.2 生化试剂及试剂盒
• 3.3 引物设计与合成
• 3.4 LB培养基及大肠杆菌感受态细胞制备所需溶液
• 3.5 DNA琼脂凝胶电泳所需试剂
• 3.6 质粒提取所需溶液
• 3.7 植物RNA提取所需溶液
• 3.8 仪器
• 3.9 实验方法
• 3.9.1 总RNA的提取
• 3.9.2 反转录（cDNA第一链的合成）
• 3.9.3 5′-EPSPS Ⅰ和3′-EPSPS Ⅰ片段的PCR扩增
• 3.9.4 5′-EPSPS Ⅰ和3′-EPSPS Ⅰ与pBS-T载体的连接
• 3.9.5 5′-EPSPS Ⅰ和3′-EPSPS Ⅰ的连接
• 3.10 结果与分析
• 3.10.1 总RNA的提取
• 3.10.2 反转录（cDNA第一链的合成）
• 3.10.3 PCR扩增产物分析
• 3.10.4 克隆鉴定
• 3.11 讨论
• 4 烟草愈伤组织培养
• 4.1 愈伤组织培养材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 MS培养基母液的配制
• 4.2.2 MS培养基的配制与灭菌
• 4.2.3 外植体的消毒及愈伤组织的诱导
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 升汞不同消毒时间对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 4.3.2 次氯酸钠不同消毒时间对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 4.3.3 两种不同培养基对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 升汞不同消毒时间对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 4.4.2 次氯酸钠不同消毒时间对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 4.4.3 两种不同培养基对茎尖、叶、种子形成愈伤组织的影响
• 5 结论
• 5.1 草甘膦对烟草超微结构的影响
• 5.2 烟草EPSPS Ⅰ基因的克隆
• 5.3 烟草愈伤组织培养
• 5.4 问题与展望
• 5.4.1 问题
• 5.4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文与科研情况