三种小分子药物人工抗原与多抗制备及蛋白芯片检测

论文摘要

兽药及其添加剂的大量使用，在促进畜牧业发展、增加产品产量和预防疾病等方面效果显著，但同时其所带来的兽药残留问题，已逐渐成为人们普遍关注的一个社会热点。兽药都为小分子药物（MW＜1000D），它的残留可以直接给人类健康造成很大危害，对人体产生许多不良反应。如蓄积性作用、耐药性的产生，以及致畸、致癌、致突变等作用。故本研究以期利用分子生物学和免疫学方法合成3种小分子药物（克伦特罗Clenbuterol CL、磺胺二甲基嘧啶Sulfamethazine SM2、磺胺喹恶啉Sulfaquinoxaline SQ）的人工抗原并制备其多克隆抗体，结合蛋白芯片平行性、高通量的特点，对其进行初步检测，为兽药残留检测产品的研制奠定基础。 小分子类药物免疫检测有其自身的特点，由于其分子量较小，为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原，必须通过改造将其交联到大分子蛋白质上制成人工抗原才能获得免疫原性。本实验选择CL、SM2、SQ作为研究对象，利用重氮方法与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、卵清蛋白（OVA）偶联。经紫外光谱扫描验证偶联成功，计算结合比CL-BSA为23：1、CL-OVA为16：1、SM2-HSA为4：1、SM2-OVA为3：1、SQ-HSA为14：1、SQ-OVA为5：1。将偶联物CL-BSA、SM2-HSA、SQ-HSA作为免疫原免疫家兔，在各期免疫后采血以CL-OVA、SM2-OVA、SQ-OVA为包被原利用间接ELISA方法测定血清效价。CL、SM2抗血清效价为1：12800，SQ抗血清效价为1：102400，证明成功获得CL、SM2、SQ的多克隆抗体，也进一步验证本实验中3种药物人工抗原合成成功。通过间接竞争ELISA法（ci-ELISA）检测CL、SM2、SQ的灵敏度IC50为174.57ng／ml、159.46ng／ml、3.532μg／ml。利用蛋白质芯片技术，将3种包被原通过芯片点样仪固定到表面经过特殊处理的玻片上，再将药物标准液与抗血清同时加入与芯片孵育，之后加入CY3标记的二抗进行反应，最后扫描芯片分析杂交结果。利用蛋白质芯片检测药物的灵敏度IC50为50.05ng／ml、48.31ng／ml、39.79ng／ml。由此表明本实验成功完成了3种小分子药物人工抗原与多抗的制备，并且也成功利用蛋白质芯片技术初步完成了对人工抗原与多抗的测定，为开拓生物芯片在药物残留检测方面提供了较好的先例。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 兽药残留的概念及管理现状
• 1.2 兽药残留危害及影响
• 1.2.1 兽药残留的危害
• 1.3 兽药残留检测方法的发展
• 1.3.1 微生物检测法
• 1.3.2 薄层色谱（TLC）
• 1.3.3 气相色谱（GC）
• 1.3.4 高效液相色谱（HPLC）
• 1.3.5 联用技术
• 1.3.6 毛细管电泳法
• 1.3.7 免疫分析法
• 1.4 CL的性质、危害以及检测方法
• 2、SQ的性质、危害以及检测方法'>1.5 SM₂、SQ的性质、危害以及检测方法
• 1.6 生物芯片技术及其在免疫分析中的应用
• 1.6.1 生物芯片技术介绍
• 1.6.2 芯片技术在免疫分析中的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重氮法合成人工抗原
• 2.2.2 偶联物紫外光谱扫描鉴定
• 2.2.3 动物免疫及间接ELISA法测定抗体效价
• 50测定'>2.2.4 药物IC₅₀测定
• 第3章 实验结果与分析
• 3.1 合成抗原鉴定与结合比计算
• 3.1.1 人工抗原蛋白浓度
• 3.1.2 紫外图谱扫描、结合比测定
• 3.2 抗血清效价与最适包被浓度测定
• 3.2.1 各期血清测定
• 3.2.2 最适包被浓度及效价测定
• 50检测'>3.3 CI-ELISA与蛋白芯片法对药物IC₅₀检测
• 3.3.1 ci-ELISA法测定
• 3.3.2 蛋白芯片法测定
• 第4章 讨论
• 4.1 人工抗原制备
• 4.2 抗体效价测定
• 4.3 灵敏度检测
• 4.4 结语
• 参考文献
• 致谢