我国2005年～2007年H5N1亚型HPAIVs生物学特性研究

论文摘要

2003年底,东南亚多个国家开始暴发H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）,我国自2004年1月26日第一起疫情出现以来,相同疫情时有发生,我国青海湖于2005年5月暴发了流感史上第一起野鸟H5N1亚型HPAI,此后,随着野鸟的迁徙,该病由亚洲逐渐传播到欧洲、非洲等地。目前,全世界多个国家遭受H5N1亚型高致病力禽流感病毒（HPAIV）的侵害,不仅养禽业损失惨重,人或其它哺乳动物也有感染及死亡病例的发生,2008年4月28日,WHO报道全世界已有384人感染,240例死亡。为全面了解引起我国2005年～2007年H5N1亚型HPAI疫情的病原的生物学特性,本文对主要分离自近3年期间家禽H5N1亚型HPAI疫情及人禽流感相关的166株H5N1亚型HPAIV进行了系统研究。首先,对全部病毒进行了全基因组核苷酸序列测定、同源性比较及遗传进化分析。从病毒的进化来源来看,这些病毒主要来自于野鸟病毒与GS/GD/1/96的基因重组。研究发现,这些病毒主要进化分为与地理相关的4个亚群:ST亚群（南方亚群,Southern China,ST）、XJ亚群（Xinjiang, XJ）、SX亚群（Shanxi, SX）和WB亚群（Wild bird,WB）,ST亚群为主要来自湖南、湖北、福建和安徽等南方省份的病毒,XJ亚群为分离自新疆的绝大多数病毒,WB亚群为分离自辽宁家禽、青海及西藏野鸟的病毒,SX亚群为分离自山西、宁夏2省的病毒。各亚群病毒具有各自的基因特征,SX亚群病毒获得了抗金刚烷胺的耐药性。4个亚群病毒共划分为11个基因型,ST亚群分为3个基因型,XJ亚群分为2个基因型,SX亚群分为2个基因型,WB亚群划分为4个基因型。ST亚群病毒与东南亚国家的病毒进化关系密切。3株人流感病毒基因特征与禽流感病毒完全相同,遗传进化地位处于ST亚群,说明其为禽源H5N1亚型HPAIV。为了解我国以地域为特征多亚群多基因型存在的2005年～2007年的H5N1亚型HPAIV的抗原性是否发生了变异,我们选取各亚群的代表病毒制备特异性血清,进行全面交叉HA-HI试验,从抗原性变异系数r值计算结果来看,SX亚群病毒与其它亚群病毒存在显著的抗原性差异,其它3亚群病毒的抗原性差异不显著。本研究对各亚群病毒的代表毒株进行了家禽的感染与致病能力评估,结果表明4亚群病毒对SPF鸡均为高致病力,但对鸭的感染和致病力有所不同,ST、XJ和WB 3个亚群的病毒能感染鸭并致病,而SX亚型病毒对鸭无感染能力。BALB/C鼠是禽流感病毒感染哺乳动物的传统模型,本研究选取各亚群病毒的代表毒株,应用传统的研究方法,对我国2005年～2007年H5N1亚型HPAIV对哺乳动物的感染和致病能力进行评估。结果表明4个亚群病毒未经适应均具有直接感染哺乳动物的能力,但对鼠的致病力不同,ST亚群病毒对鼠的致病性呈高、中、低三种,WB亚群病毒对鼠表现为高致病性;XJ和SX亚群病毒对鼠呈低致病性。本研究对从我国海关截获的越南旅客行李中携带的禽蛋表面冲洗物中分离到的3株H5N1亚型HPAIV VN1、VN3和VN8同时开展了遗传进化与动物感染能力研究。结果发现3株越南病毒的8个基因片段均与HK/156/97高度同源,进化地位与其处于同一分支,为早期的HK/97-like病毒。该3株病毒对鸡表现为高致病性,对SPF鸭为低致病力,未经适应能够直接感染BALB/C小鼠,但表现为低致病力,仅在鼠的肺脏中复制。在对H5N1亚型HPAIV开展研究的同时,本文对我国目前唯一的一株分离自家禽的H7亚型禽流感病毒CK/HeB/1/02（H7N2）进行了全面分析,遗传进化发现该病毒主要来源于野鸟,由多个亚型禽流感病毒多基因重组产生。该病毒的IVPI数据及HA基因裂解位点显示为低致病力毒株,SPF鸡的静脉接种和鼻腔感染结果表明其在鸡体内的复制能力较低。BALB/C鼠的感染实验结果显示其具有直接感染哺乳动物能力,尽管为低致病力,但能在哺乳动物体内多器官有效复制。本研究通过对我国2005年～2007年的166株H5N1亚型HPAIV的全面系统研究,首次对引起我国近年疫情的病毒进行了全面的生物学特性分析。发现我国近年的H5N1亚型HPAIV主要以地域为特点多亚群多基因型存在,各亚群病毒具有独立的基因特征。并发现了对金刚烷胺具有耐药性及抗原性明显变异的亚群。评估了各亚群病毒对家禽及哺乳动物的感染与致病能力差异;阐明了3株人禽流感病毒为禽源H5N1亚型流感病毒;研究发现了HK/97-like的3株越南H5N1亚型HPAIV;对目前唯一的一株H7N2亚型低致病力禽流感病毒,进行了全面的生物学特性研究。本研究的重要发现填补了我国禽流感病毒研究,特别是H5N1亚型HPAIV相关研究的一项空白,并为H5N1亚型HPAIV不同宿主致病性分子机制研究奠定了基础,并为H5N1HPAIV不同宿主致病性分子机制研究奠定了坚实的基础,本研究结果对深入掌握国、内外H5亚型高致病力禽流感病毒的遗传演化、生物学表型与致病性变化规律具有重要价值,对疫情的预警预报、防控措施的拟定乃至疫苗研制提供了至关重要的理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 流感病毒宿主特异性的分子基础
• 1.2 流感病毒致病性的分子基础
• 1.2.1 HA基因
• 1.2.2 NA基因
• 1.2.3 聚合酶复合体基因
• 1.2.4 NP基因
• 1.2.5 M基因
• 1.2.6 NS基因
• 1.3 我国H5N1 亚型HPAI流行现状
• 1.3.1 家禽疫情
• 1.3.2 野鸟疫情
• 2007 年引起我国 H5N1HPAI 疫情的病毒数量及宿主分布'>1.3.3 2005²007 年引起我国 H5N1HPAI 疫情的病毒数量及宿主分布
• 1.4 流感病毒的变异
• 1.4.1. 致病性变异
• 1.4.2. 抗原性变异
• 1.5 高致病力禽流感的公共卫生意义
• 1.6 人患禽流感
• 1.6.1 流行病学
• 1.6.2 流行病学史
• 1.6.3 临床表现
• 1.6.4 人患禽流感诊断
• 1.6.5 人患禽流感治疗
• 1.6.6 人禽流感预防
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 H5N1 亚型HPAIV的遗传进化分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒
• 2.1.2 SPF鸡及SPF鸡胚
• 2.1.3 主要试剂与试剂盒
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒核酸的提取
• 2.2.2 cDNA合成
• 2.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物
• 2.2.5 PCR 产物回收和纯化
• 2.2.6 PCR 回收产物鉴定
• 2.2.7 全基因的序列测定
• 2.2.8 cDNA核苷酸、推导的氨基酸序列比较及系统进化树绘制
• 2.3 结果
• 2.3.1 HA基因的遗传进化分析
• 2.3.2 NA基因的遗传进化分析
• 2.3.3 PB2 基因的遗传进化分析
• 2.3.4 PB1 基因的遗传进化分析
• 2.3.5 PA基因的遗传进化分析
• 2.3.6 NP基因的遗传进化分析
• 2.3.7 M基因的遗传进化分析
• 2.3.8 NS基因的遗传进化分析
• 2.3.9 我国H5N1 亚型HPAIV基因型的划分
• 2.4 讨论
• 2.4.1 HA基因
• 2.4.2 NA基因
• 2.4.3 聚合酶基因
• 2.4.4 NP基因
• 2.4.5 M基因
• 2.4.6 NS基因
• 2.4.7 我国H5N1 亚型HPAIV的多基因型存在
• 2.4.8 人禽流感
• 2.4.9 3 株越南病毒的发现
• 第三章 H5N1 亚型HPAIV的抗原性分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 病毒
• 3.1.2 实验室耗材
• 3.1.3 生物安全性
• 3.2 方法
• 3.2.1 病毒特异性血清制备
• 3.2.2 交叉血凝－血凝抑制（HA-HI）试验
• 3.2.3 抗原性差异分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 交叉HA-HI实验结果
• 3.3.2 r值
• 3.4 讨论
• 3.4.1 大多数H5N1 亚型HPAIV无抗原性差异
• 3.4.2 SX亚群与其它亚群病毒存在明显差异
• 3.4.3 变异株亚群病毒的防制
• 3.4.4 变异株亚群病毒的出现
• 第四章 H5N1 亚型HPAIV对家禽的感染与致病性研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 病毒
• 4.1.2 SPF鸡、SPF鸭
• 4.1.3 生物安全性
• 4.2 方法
• 4.2.1 鸡胚半数感染量（EID50）测定
• 4.2.2 静脉接种指数（IVPI）测定
• 4.2.3 SPF鸭感染与致病性试验
• 4.2.4 非免疫鹅的感染与致病性试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 EID50 与IVPI测定结果
• 4.3.2 我国H5N1 亚型HPAIV对SPF鸭感染与致病性试验结果
• 4.3.3 3 株越南病毒SPF鸭的感染与致病性试验结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 高致病力禽流感病毒
• 4.4.2 我国H5N1 亚型HPAIV对鸭的致病力不同
• 4.4.3 H5N1 亚型HPAIV对鸭致病力强弱的判断
• 4.4.4 3 株越南病毒
• 第五章 H5N1 亚型HPAIV对哺乳动物的感染与致病性研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 病毒
• 5.1.2 BALB/C小鼠
• 5.1.3 SPF 鸡胚、0.5%鸡红细胞
• 5.1.4 生物安全性
• 5.2 方法
• 5.2.1 实验分组
• 5.2.2 MLD50 测定
• 5.2.3 鼠的感染与致病性试验
• 5.2.4 组织病毒含量测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 MLD50
• 5.3.2 感染鼠的死亡
• 5.3.3 感染后第3 天病毒复制
• 5.3.4 感染鼠的体重变化
• 5.4 讨论
• 5.4.1 H5N1 亚型HPAIV对鼠的感染与致病性
• 5.4.2 H5N1 亚型HPAIV跨种间传播机理
• 第六章 H7N2 亚型禽流感病毒特征
• 6.1 材料
• 6.1.1 毒株
• 6.1.2 SPF鸡及鸡胚
• 6.1.3 BALB/C鼠
• 6.1.4 生物安全性
• 6.2 方法
• 6.2.1 病毒的有限稀释克隆纯化
• 6.2.2 鸡胚半数感染量（EID50）和鸡胚平均死亡时间（MDT）测定
• 6.2.3 SPF鸡的感染与致病性试验
• 6.2.4 抗原性分析
• 6.2.5 鼠的感染与致病性试验
• 6.2.6 序列测定
• 6.2.7 同源性比较及遗传进化分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 EID50 及MDT的测定结果
• 6.3.2 IVPI
• 6.3.3 SPF鸡接种后排毒
• 6.3.4 血清抗体监测
• 6.3.5 抗原性分析
• 6.3.6 感染鼠的体重变化
• 6.3.7 感染鼠脏器病毒复制
• 6.3.8 MLD50
• 6.3.9 遗传进化分析
• 6.4 讨论
• 6.4.1 目前我国唯一的H7 亚群禽流感病毒
• 6.4.2 CK/HeB/1/02（ H7N2）的进化
• 6.4.3 CK/HeB/1/02（ H7N2）对禽的感染能力
• 6.4.4 CK/HeB/1/02（ H7N2）对哺乳动物的感染能力
• 6.4.5 CK/HeB/1/02（ H7N2）的发现
• 第七章 全文结论
• 7.1 我国H5N1 亚型HPAIV的遗传进化
• 7.2 我国H5N1 亚型HPAIV的抗原性变异
• 7.3 我国H5N1 亚型HPAIV对家禽的感染和致病能力
• 7.4 我国H5N1 亚型HPAIV对哺乳动物的感染和致病能力
• 7.5 人H5N1 亚型禽流感病毒
• 7.6 3 株越南H5N1 亚型HPAIV
• 7.7 我国H7N2 亚型AIV特征
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历