草鱼肝肾cDNA文库构建及部分功能基因的序列分析

论文摘要

本文以草鱼肝脏和肾脏为实验材料,采用Oligo（dT）引物定向克隆技术构建了草鱼肝肾脏组织的cDNA文库,随机对其中510个克隆测序并利用生物信息学方法对这些序列进行了初步的分类分析。首先,利用TRIzol法抽提草鱼肝肾脏组织总RNA,用Oligotex mRNA Kits从总RNA中分离纯化富含Poly（A）的mRNA。反转录合成单链cDNA,PCR扩增得到双链cDNA,连接EcoR I接头,末端磷酸化,Sfi I消化,回收双末端黏性化的双链cDNA。筛选收集大于500bp的cDNA片段,加工后与pBlueseriptllsK（+）vector连接,转入DH-5α宿主菌。挑取阳性克隆,做菌液PCR检测,文库库容量为1.15×106,重组率达94%。所构建的cDNA文库容量符合今后的研究要求。测序得到草鱼510个的cDNA序列,长度约为410-840bp,共315个Unigene。其中已知功能的基因有150个,主要与转录调节、翻译、核糖体结构、生物合成、细胞分裂、免疫、生长发育、生殖、特殊刺激、蛋白质的修饰和降解、生理调节、细胞膜结构、细胞内物质运输、细胞信号转导、物质代谢等有关。最后对全长基因进行了初步的结构和功能的分析。本文构建了草鱼肝肾cDNA文库,可以方便地从中筛选所需目的基因,更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 减数cDNA文库
• 1.1.1 使用磁珠的减数技术
• 30乳胶和PCR结合的方法'>1.1.2 Oligo（dT）₃₀乳胶和PCR结合的方法
• 1.1.3 代表性差别筛选法
• 1.1.4 酶降解减数法
• 1.2 标准化cDNA文库
• 1.3 固相cDNA文库构建
• 1.4 差示cDNA文库
• 1.5 抑制消减杂交
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 cDNA文库的构建
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 草鱼的诱导
• 2.3.2 草鱼肝、肾组织的分离
• 2.3.3 样品total RNA抽提
• 2.3.4 mRNA纯化
• 2.3.5 cDNA合成、酶切及分级分离
• 2.3.5.1 cDNA第一链合成
• 2.3.5.2 LD PCR扩增cDNA
• 2.3.5.3 蛋白酶K消化
• 2.3.5.4 Sfi I消化
• 2.3.5.5 cDNA的分级分离
• *载体相连'>2.3.6 将cDNA与pBluescript II SK^*载体相连
• 2.3.7 重组质粒的转化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 Total RNA的质量检测
• 2.4.1.1 紫外分析RNA的质量
• 2.4.1.2 保温实验检测RNA质量
• 2.4.2 mRNA质量检测
• 2.4.3 双链cDNA的合成检测
• 2.4.4 cDNA分级分离结果检测
• 2.4.5 重组率及库容
• 2.4.5.1 计算菌落数及蓝白斑比例
• 2.4.5.2 库容量
• 2.4.6 小结
• 第三章 cDNA文库的筛选及保存
• 3.1 实验材料
• 3.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 cDNA文库的筛选
• 3.3.1.1 感受态细胞的制备和连接产物的转化
• 3.3.1.2 阳性克隆筛选
• 3.3.2 cDNA文库的保存
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 PCR检测插入片段
• 第四章 测序结果及部分功能基因序列分析
• 4.1 草鱼肝肾cDNA文库中部分基因及其序列的初步统计
• 4.2 全长序列分析
• 4.3 文库的初步评估
• 第五章 讨论
• 5.1 cDNA全长文库
• 5.2 构建cDNA文库的基本步骤
• 5.3 构建cDNA文库注意事项
• 5.4 如何判断全长序列
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1:缩略语
• 附录 2:论文发表情况