不结球白菜与TuMV互作过程中内源激素的变化及抗病相关基因的克隆

论文摘要

不结球白菜是长江中下游地区主要的蔬菜品种之一,在蔬菜周年供应上占据重要地位,但不结球白菜病害相当严重,给广大菜农造成了极大的经济损失。芜菁花叶病毒病是夏秋季最为严重病害之一。植株受芜菁花叶病毒（TuMV）侵染后,会产生一系列细胞病理效应,这种效应可能会引起植株内源激素的变化。在植物抗病毒机制研究中发现,真核翻译起始因子4E在病毒侵染和复制过程中起着至关重要的作用。本研究揭示了TuMV与不结球白菜互作过程中内源激素的动态变化及其代谢相关基因的表达,并克隆得到了不结球白菜真核翻译起始因子4E及其异构体基因（BceIF4E和BceIF（iso）4E）,成功构建了RNAi表达载体,为了解TuMV的致病机制,进一步开展不结球白菜病毒抗性研究工作奠定了一定的基础。1.采用ELISA和Real-time PCR技术研究了TuMV胁迫下不结球白菜内源生长素（IAA）,赤霉素（GA3）,脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的动态变化以及内源激素相关基因的表达差异。结果表明,TuMV侵染后,植株发病症状的严重程度与IAA含量呈正相关；光敏色素相关蛋白基因PAP1对IAA的合成起负调控作用。处理植株体内GA3含量及其代谢相关基因,即原表皮因子基因PDFl表达量均明显低于对照植株,而ABA含量则随着接种时间的延长不断积累,始终高于对照植株。且发病症状越严重的植株中,GA3含量越低,ABA含量越高。处理植株JA含量和JA诱导基因,即营养贮藏蛋白基因Vspl表达量在接种后则出现了两次上升,且植株病症越严重,JA含量越低。TuMV胁迫下,植株中IAA/ABA和GA3/ABA的比值则明显低于对照植株,表明TuMV的侵染破坏了内源激素的平衡,干扰了植物的正常生长发育。2.从不结球白菜中克隆到一个真核翻译起始因子4E基因,命名为BceIF4E。该基因核苷酸序列全长851bp,编码234个氨基酸,与已克隆的植物真核翻译起始因子4E具有不同程度的同源性。系统进化分析表明,该基因与芜菁和拟南芥亲缘关系最近。Target P server和WOLFPSORT程序预测该蛋白为细胞质蛋白。利用GatewayTM技术和pHellsgate 12载体,成功构建了BceIF4E基因的RNAi表达载体,为进一步研究BceIF4E在病毒与不结球白菜互作中的功能提供了理论和技术支持。3.以不结球白菜感病品种‘矮脚黄’为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术,获得了不结球白菜真核翻译起始因子4E异构体基因的cDNA全长序列,并将其命名为BceIF（iso）4E.序列分析表明,该基因全长721bp,编码200个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸与其他植物的真核翻译起始因子4E异构体具有不同程度的同源性,与芜菁和拟南芥最先聚为一类,亲缘关系最近。SignalP3.0 Serve程序分析BceIF（iso）4E蛋白可能为非分泌蛋白,Target P server和WOLFPSORT程序预测该蛋白为细胞质蛋白。应用GatewayTM技术体系替代传统载体构建方法,成功构建了BceIF（iso）4E基因的RNAi表达载体,为BceIF（iso）4E基因在不结球白菜抗病毒中的功能研究打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 芸薹属植物芜菁花叶病毒病研究进展
• 1.1 病原
• 1.2 病症
• 1.3 寄主与传播途径
• 1.4 发生与流行
• 1.5 芸薹属植物抗病性研究
• 2 植物病毒与内源激素的关系研究进展
• 2.1 植物病毒对生长素（IAA）的影响
• 2.2 植物病毒对赤霉素（GA）的影响
• 2.3 植物病毒对脱落酸（ABA）的影响
• 2.4 植物病毒对茉莉酸（JA）的影响
• 3 翻译起始因子4E及其异构体介导的抗病毒机理
• 3.1 植物的抗病与感病
• 3.2 翻译起始因子4E的结构与功能
• 3.3 翻译起始因子4E与植物病毒的关系
• 3.4 翻译起始因子4E抗病毒机制
• 第二章 TuMV对不结球白菜内源激素含量及代谢相关基因转录水平的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 田间病株病毒病原检测
• 1.3 田间不同病情级别鉴定及取样
• 1.4 接种处理及取样
• 1.5 激素含量测定
• 1.6 Real-Time PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒提纯及电镜诊断
• 2.2 TuMV胁迫下内源激素含量变化
• 2.3 TuMV胁迫下内源激素比值变化
• 2.4 TuMV胁迫下内源激素代谢相关基因相对表达量比较
• 3 讨论
• 第三章 不结球白菜BceIF4E基因的克隆及其RNAi表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不结球白菜总RNA的提取
• 2.2 不结球白菜BceIF4E基因的全长克隆及拼接
• 2.3 不结球白菜BceIF4E编码的氨基酸序列同源性及进化树分析
• 2.4 不结球白菜BceIF4E蛋白信号肽及亚细胞定位的预测和分析
• 2.5 不结球白菜BceIF4E基因RNAi载体的构建与鉴定
• 2.6 载体在农杆菌中的转化
• 3 讨论
• 第四章 不结球白菜BceIF（iso）4E基因的克隆及其RNAi表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不结球白菜BceIF（iso）4E基因cDNA全长的克隆
• 2.2 不结球白菜BceIF（iso）4E基因cDNA全长的拼接及序列分析
• 2.3 不结球白菜BceIF（iso）4E编码的氨基酸序列同源性及进化树分析
• 2.4 不结球白菜BceIF（iso）4E蛋白信号肽及亚细胞定位的预测和分析
• 2.5 不结球白菜BceIF（iso）4E基因RNAi载体的构建与鉴定
• 2.6 载体在农杆菌中的转化
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢