水稻OsHSP基因表达分析与遗传转化研究

论文摘要

非生物胁迫诸如干旱胁迫、盐分胁迫、温度胁迫、重金属污染和氧化胁迫影响着植物的生长发育,是导致作物减产的重要因素。利用分子生物学技术和基因工程手段发掘植物耐逆性相关基因并阐明其分子机制对作物改良有重要意义。热激蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）是一类重要的胁迫诱导蛋白,能提高植物抗御逆境胁迫的能力。本实验选取了9个热诱导的水稻OsHSP基因分析了其表达模式、构建了植物表达载体并采用农杆菌介导法转化水稻,得到以下结果:1.以水稻幼根、茎、叶、叶鞘、幼穗和萌动胚6种组织样品为材料,用半定量RT-PCR的方法研究了水稻9个OsHSP基因在各组织的表达模式。9个OsHSP基因的表达存在时空特异性。其中OsHSP80.2在根中存在高表达;OsHSP24.1和OsHSP17.0在茎和穗中表达量较高;OsHSP74.8、OsHSP71.1、OsHSP50.2、和OsHSP23.7在叶片和叶鞘存在较高的表达;OsHSP71.1和OsHSP26.7在萌动胚中的表达较高。2.用半定量RT-PCR的方法研究了水稻9个OsHSP基因在高温、低温、高盐、模拟干旱和ABA胁迫下的表达模式。结果显示,9个OsHSP基因都能被高温诱导但对低温都不敏感;OsHSP80.2,OsHSP71.1和OsHSP23.7受NaCl胁迫诱导;OsHSP80.2和OsHSP24.1受干旱胁迫诱导;在ABA处理下,OsHSP71.1的表达被上调,而OsHSP24.1的表达被下调,另外7个OsHSP基因的表达没有明显变化。这些结果说明了OsHSP基因与许多环境逆境都有着一定的应答关系,并且可能通过ABA依赖途径或非ABA依赖途径在逆境胁迫中发挥作用。3.构建了9个OsHSP基因过表达表达载体和2个OsHSP基因的RNAi表达载体。2个RNAi表达载体和其中6个过表达表达载体采用农杆菌介导法转化水稻。其中5个过表达载体转化获得了抗性植株。PCR检测表明,OsHSP71.1-OE得到阳性转基因植株12株;OsHSP23.7-OE得到阳性转基因植株6株。半定量RT-PCR分析表明OsHSP71.1-OE和OsHSP23.7-OE的阳性转基因植株在转录水平超量表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 植物HSPs的种类
• 1.2 植物HSPs的诱导表达
• 1.3 逆境胁迫下HSPs的生物学功能
• 1.3.1 维持天然蛋白结构的稳定
• 1.3.2 维护生物膜结构稳定
• 1.3.3 维持ROS平衡
• 1.4 HSPs与作物改良研究进展
• 1.4.1 HSPs与作物耐热性的改良
• 1.4.2 HSPs与作物耐冷性的改良
• 1.4.3 HSPs与作物耐旱性的改良
• 1.5 水稻HSPs研究现状
• 1.6 本课题的研究背景、目的及意义
• 第二章 9个OsHSP基因表达特征分析
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 缓冲液
• 1.3 酶和其他试剂
• 1.4 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1.候选基因的选取
• 2.2 候选基因的进化分析
• 2.3 引物设计
• 2.4 表达分析的材料准备
• 2.5 水稻组织总RNA提取
• 2.6 基因表达模式的半定量RT-PCR分析
• 2.6.1 cDNA第一链的合成
• 2.6.2 模板浓度的调整
• 2.6.3 RT-PCR分析
• 3 结果与分析
• 3.1 候选基因的系统树分析
• 3.2 9个OsHSP在水稻不同器官中的表达分析
• 3.3 不同逆境胁迫下9个OsHSP的表达特征研究
• 4 讨论
• 4.1 OsHSP表达具有组织特异性
• 4.2 不同逆境胁迫及ABA处理下OsHSP的表达特征
• 第三章 表达载体的构建及对水稻的遗传转化
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 工具酶和其它试剂
• 1.4 常用实验仪器
• 1.5 培养基
• 2 试验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 过表达载体和RNAi表达载体的构建
• 2.2.1 过表达载体构建技术路线
• 2.2.2 RNAi表达载体构建技术路线
• 2.2.3 PCR扩增
• 2.2.4 PCR扩增片段与p1300M载体的重组
• 2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.6 大肠杆菌细胞的热激法转化
• 2.2.7 转化子的检测
• 2.2.8 农杆菌感受态细胞制备
• 2.2.9 农杆菌细胞的冻融法转化与检测
• 2.3 农杆菌介导的遗传转化
• 2.3.1 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2.3.2 农杆菌菌液的准备
• 2.3.3 愈伤组织与根癌农杆菌的共培养
• 2.3.4 洗除农杆菌
• 2.3.5 抗性愈伤组织筛选和植株再生
• 2.4 转基因植株的分子检测
• 2.4.1 水稻叶片总DNA的提取
• 2.4.2 转基因植株的PCR检测
• 2.4.3 半定量PT-PCR分析
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体的构建
• 3.2 表达载体的验证
• 3.3 农杆菌介导的水稻转化
• 3.4 DNA水平PCR检测
• 3.5 转录水平RT-PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 植物表达载体的构建
• 4.2 愈伤状态对转化的影响
• 4.3 湿度对愈伤生长的影响
• 4.4 载体转化未能分化出抗性苗的可能原因
• 4.5 转化的周期和效率
• 第四章 总结及下一步研究设想
• 1 结论
• 2 下一步研究设想
• 参考文献
• 附录2 本研究中所用的基本培养基配方
• 附录3 缩写词
• 致谢
• 作者简介