猪胆囊收缩素基因的克隆表达及其调节猪采食量的生物学功能研究

论文摘要

胆囊收缩素（CCK）是一种被广泛研究的食欲饱感因子。化学合成的CCK-8无论是硫酸化还是非硫酸化形式都很昂贵,本课题的目的是研究采用基因工程技术外源表达猪的CCK-33多串联体重组蛋白的抗原性及提高猪采食量的生物学功能。本研究应用基因工程技术构建了优化后的猪CCK-33基因九串联体的重组质粒并在大肠杆菌中表达了CCK-33九串联体（Z9CCK）重组蛋白,证明了Z9CCK重组蛋白的抗原性,用Z9CCK重组蛋白诱导产蛋鸡产生卵黄抗体来制备抗Z9CCK卵黄抗体。用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,对Z9CCK调节猪的采食量和体增重的效果以及Z9CCK主动免疫对猪血清激素及其它成分的影响进行了研究。结果如下:1.以质粒pRESET B为克隆载体,大肠杆菌DH5α为克隆宿主菌,克隆了pRSET B-Z9CCK重组质粒;以原核表达载体pRESET B为表达载体,BL21（DE3）为表达宿主菌,表达了Z9CCK重组蛋白。根据NCBI上已发表的猪CCK-33基因序列和参照大肠杆菌密码子使用数据库（Codon usage database,网址:www.kazusa.or.jp/codon）,设计合成了大肠杆菌表达系统偏爱的猪CCK-33基因优化序列。将合成的猪CCK-33优化序列通过PCR扩增、酶切、连接、转化克隆至pRSET B质粒上,分别获得不带终止子和带终止子CCK-33基因单体pRSETB-1CCK的重组质粒。在此基础上利用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶的原理,经多次克隆最终成功构建了带终止子的pRSET B-Z3CCK、pRSETB-Z5CCK、pRSET B-Z7CCK、pRSET B-Z9CCK重组质粒。对构建好的CCK-33多串联体基因测序,结果与理论设计的完全吻合。将经过测序鉴定为阳性克隆的CCK-33七、九串联体转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中,用IPTG诱导表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达出的七、九串联体目的蛋白分别占菌体总蛋白的28%和35.6%左右。对Z9CCK重组蛋白表达条件的优化发现:IPTG诱导4h为最佳诱导时间,Z9CCK重组蛋白表达对IPTG浓度不敏感。由此表明:原核表达可以提供大量的CCK蛋白,用较低浓度的IPTG（终浓度为0.2mmol/L）诱导Z9CCK重组蛋白表达而不影响它的表达量,降低了成本。2.用“Bepipred Linear Epitope Prediction”方法预测了Z9CCK重组蛋白的抗原性,用Western-blot方法和间接ELISA试验证明了Z9CCK重组蛋白的抗原性。利用网址:http://www.immuneepitope.org/tools/bcell/tutorial.jsp上介绍的“BepipredLinear Epitope Prediction”方法对Z9CCK重组蛋白进行抗原性预测,发现每一个CCK-33单体分子具有两个抗体识别的抗原表位（1-6:PKAPSGR;16-24:SLDPSHRIS）,一个Z9CCK重组蛋白分子具有18个线性抗原表位,初步验证了Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性。以兔抗CCK-8阳性抗血清为一抗,以山羊抗兔抗体为二抗,用Western-blot方法检测显示Z9CCK重组蛋白能与兔抗CCK-8抗体特异性结合,表明Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。以化学合成的CCK-8与牛血清白蛋白（BSA）的交联物作为包被抗原,用提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡获得的抗Z9CCK抗体为一抗,以鼠抗鸡IgY为二抗,用间接ELISA试验表明抗Z9CCK抗体能与化学合成的CCK-8发生抗体、抗原特异性结合反应,同样证明了Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。因此,Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性,且具有CCK-8的抗原性。3.用提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡,监测了鸡蛋中抗Z9CCK抗体的效价变化,并制备了抗Z9CCK卵黄抗体。将Z9CCK重组蛋白油乳苗主动免疫28周龄海蓝褐蛋鸡750只,左右胸肌各注射0.5mL/次（500μg Z9CCK/mL）,免疫程序为试验期第1d初次免疫和第15、29d各加强免疫1次。以提纯的Z9CCK重组蛋白作包被抗原,鸡蛋样品倍比稀释后作为一抗,鼠抗鸡IgY为二抗,用间接ELISA检测鸡蛋中的抗Z9CCK抗体效价。结果发现:在2免1周后鸡蛋中CCK抗体水平便明显升高,平均效价可达2000以上,且此抗体水平可以维持到2免22周。当CCK抗体效价达到高峰73516.69时,收集鸡蛋进行喷雾干燥加工成粉,间接ELISA检测卵黄粉样品中的CCK抗体平均效价为22627.42。ELISA试验还证明Z9CCK重组蛋白具有CCK-8的抗原性。因此,Z9CCK重组蛋白可以作为CCK卵黄抗体生产的候选抗原。4.将提纯的Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,通过生长肥育猪的饲养试验研究Z9CCK重组蛋白对猪的采食量和体增重的调节效果。选择63±3d长新品系生长肥育猪72头,按体重相对一致的原则随机分成2组,每组9个重复,每个重复4头猪,共36头/组。试验组免疫Z9CCK重组蛋白油乳苗2mL（500μgZ9CCK/mL）,左右颈部肌肉各注射1mL;对照组免疫生理盐水,左右颈部肌肉各1mL。免疫程序为试验期第1d进行初次免疫,第29、57d各加强免疫一次。试验结果表明:（1）Z9CCK主动免疫在生长肥育猪体内能有效地产生CCK抗体,用化学合成的CCK-8作包被抗原,间接ELISA试验证明CCK抗体能与CCK-8特异性结合;在第29d,从试验组猪血清中检测到了CCK抗体,第43d达到高峰。（2）试验期1-4周,试验组和对照组采食量和日增重都没有显著差异;5-6周,试验组采食量和日增重与对照组相比又提高的趋势,分别比对照组提高了3.72%（P=0.10）和5.89%（P=0.07）;7-8周试验组采食量和日增重分别比对照组提高了5.02%（P=0.31）和6.38%（P=0.34）;9-10周试验组采食量比对照组提高了7.22%（P=0.09）,日增重比对照组提高了3.80%,差异不显著。全期试验组采食量比对照组提高了2.23%（P=0.23）,日增重比对照组提高了2.03%,差异不显著。由此表明:Z9CCK重组蛋白主动免疫能提高生长肥育猪的采食量和日增重。5.用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪,通过对猪采食前、采食中、采食后血液的动态采集,研究Z9CCK主动免疫对血清激素及其它成分的影响。Z9CCK主动免疫生长肥育猪饲养试验（见上一节）结束后,试验组和对照组各选4头健康、体重一致的猪,耳静脉安装留置针,对其实施采食前0min、开始采食后15min、30min、1h、2h连续动态采血,用相关试剂盒测定血浆中CCK、胰岛素、血糖的浓度。试验结果表明:开始采食后1h,试验组血液中CCK比对照组低4.73%（P=0.13）;开始采食后15min,试验组猪体内胰岛素浓度显著低于对照组（P＜0.05）,比对照组低31.62%;开始采食后1h,试验组猪比对照组血糖浓度高17.35%（P=0.19）。由此表明:Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪对猪血液中CCK、胰岛素、血糖具有调节作用,为进一步阐释CCK调节动物采食量的生理机制提供理论基础。综上所述,得出如下结论:应用基因工程技术在大肠杆菌表达系统中可以成功表达猪CCK-33多串联体重组蛋白,表达出的Z9CCK重组蛋白占菌体总蛋白的35.6%左右。经试验证明Z9CCK重组蛋白具有良好的抗原性,且具有CCK-8的抗原性。用Z9CCK重组蛋白作为抗原主动免疫产蛋鸡可以有效地诱发蛋鸡产生CCK抗体,CCK抗体可以有效地沉积到鸡蛋中去,将效价高峰期的鸡蛋收集起来进行喷雾干燥加工可以制备较高效价的CCK卵黄粉,Z9CCK可以作为CCK卵黄抗体生产的候选抗原。用Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪可以提高生长肥育猪的采食量和日增重。Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪对猪血液中CCK、胰岛素、血糖具有调节作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第一章 文献综述
• 1 胆囊收缩素（CCK）
• 1.1 CCK的性质
• 1.2 CCK的化学结构
• 1.3 CCK的分布
• 2 CCK受体及其分布
• 3 CCK调节采食的机制
• 3.1 早期CCK调节采食的假说
• 3.2 CCK调节采食的生理机制
• 3.3 CCK调节采食的神经机制
• 4 CCK主动免疫与动物采食的调节
• 5 CCK抗体对动物采食的影响
• 6 CCK调节动物采食的应用研究
• 6.1 CCK主动免疫调节动物采食的应用
• 6.2 CCK卵黄抗体被动免疫改善饲料利用率的应用研究
• 7 胆囊收缩素（CCK）基因的克隆表达
• 7.1 CCK基因的克隆
• 7.2 CCK基因在真核细胞中的表达
• 7.3 CCK基因在原核细胞中的表达
• 本研究的目的与意义
• 第二章 猪CCK-33基因多串联体的克隆表达
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒载体
• 2.2 试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 溶液
• 2.5 CCK-33目的基因的扩增
• 2.6 重组质粒CCK-33一串联体的构建
• 2.7 重组质粒CCK-33二串联体的构建
• 2.8 重组质粒CCK-33三串联体的构建
• 2.9 重组质粒CCK-33五串联体的构建
• 2.10 重组质粒pRSET B-Z7CCK七串联体的构建
• 2.11 重组质粒pRSET B-Z9CCK九串联体的构建
• 2.12 CCK-33多串联体构建过程如图2-2所示
• 2.13 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.14 表达产物可溶性分析
• 2.15 Z9CCK重组蛋白诱导表达条件优化
• 3 结果与分析
• 3.1 CCK、Z1CCK的PCR扩增
• 3.2 pRSET B-1CCK和pRSET B-Z1CCK质粒的PCR检测
• 3.3 BH1CCK和BHZ1CCK的PCR扩增
• 3.4 CCK-33多串联体的PCR检测
• 3.5 pRSET B质粒的酶切
• 3.6 pRSET B-2CCK、pRSET B-Z3CCK的酶切
• 3.7 pRSET B-Z5CCK、pRSET B-Z7CCK的酶切
• 3.8 pRSET B-Z9CCK的酶切鉴定
• 3.9 猪CCK-33多串联体重组蛋白的表达
• 4 讨论
• 4.1 猪CCK-33大肠杆菌偏爱密码子序列的设计
• 4.2 CCK-33多串联体的克隆
• 4.3 CCK-33多串联体的表达
• 第三章 Z9CCK重组蛋白抗原性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 抗体
• 2.2 溶液
• 2.3 Z9CCK重组蛋白抗原性预测
• 2.4 Western blot检测Z9CCK重组蛋白的抗原性
• 2.5 间接ELISA检测Z9CCK重组蛋白的抗原性
• 3 结果与分析
• 3.1 Z9CCK重组蛋白抗原性预测
• 3.2 Z9CCK重组蛋白的Western blot检测
• 4 讨论
• 4.1 B细胞识别抗原表位预测
• 4.2 Western-blot检测Z9CCK重组蛋白的抗原性
• 第四章 Z9CCK重组蛋白主动免疫产蛋鸡及卵黄抗体的制备
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验动物
• 2.2 试剂
• 2.3 佐剂
• 2.4 抗体
• 2.5 缓冲液
• 2.6 包被抗原
• 2.7 Z9CCK重组蛋白提取纯化
• 2.8 Z9CCK重组蛋白油乳苗的制备
• 2.9 Z9CCK重组蛋白诱导卵黄抗体的产生
• 2.10 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价
• 3 结果与分析
• 3.1 提纯Z9CCK重组蛋白
• 3.2 ELISA检测鸡蛋中CCK抗体效价
• 3.3 ELISA检测卵黄粉中CCK抗体效价
• 4 讨论
• 4.1 Z9CCK重组蛋白的纯化
• 4.2 Z9CCK重组蛋白诱导卵黄抗体产生
• 第五章 Z9CCK重组蛋白主动免疫生长肥育猪及对生长性能的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 试验动物
• 2.3 试验日粮
• 2.4 饲喂管理
• 2.5 猪生长性能指标测定
• 2.6 Z9CCK重组蛋白油乳苗的制备
• 2.7 免疫程序及血液样品采集
• 2.8 用CCK-8作包被抗原对血清中CCK抗体效价的测定
• 2.9 动态采血及血液指标测定
• 2.10 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Z9CCK重组蛋白主动免疫对猪生长性能的影响
• 3.2 Z9CCK重组蛋白主动免疫对生长猪血清中CCK抗体滴度的影响
• 3.3 Z9CCK重组蛋白主动免疫对猪部分血液生化指标的影响
• 4 讨论
• 4.1 Z9CCK主动免疫对生长猪生长性能的影响
• 4.2 CCK抗体滴度与动物生长性能的关系
• 4.3 CCK主动免疫对血清激素及其它指标的影响
• 第六章 结束语
• 1 结论
• 1.1 Z9CCK重组蛋白基因的克隆表达
• 1.2 Z9CCK重组蛋白的抗原性研究及调节猪采食量的功能研究
• 2 进一步研究CCK重组蛋白的表达及提高采食量的功能研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录 在读期间发表的主要研究论文