论文题目: 反义寡核苷酸肝靶向制剂的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 药剂学
作者: 程立华
导师: 潘卫三,王思玲
关键词: 反义寡核苷酸,聚赖氨酸,脂质体,人肝癌细胞,体内分布,调亡,蛋白表达
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 反义寡核苷酸是目前发展迅速的基因治疗药物，与传统药物相比，直接作用于产生蛋白的基因，因此更具有选择性和高效低毒性。但其分子量大、水溶性以及分子表面带有很强的负电荷，使其在实际应用中存在稳定性差、细胞膜通透率低和产生非特异性的毒副作用等问题。基于以上原因，本课题主要针对survivin mRNA编码区438位合成反义寡核苷酸，并将碱性氨基酸(寡聚赖氨酸)共价偶联到水溶性反义寡核苷酸，利用多聚阳离子的荷正电性质，从而有效的增加脂质体的包封率，提高细胞膜的通透性。此外，以十八烷基结合半乳糖为人肝癌细胞的靶向配体并嵌和在脂质体膜上，利用肝脏细胞表面表达的去唾液酸糖蛋白受体，构成导向性转运系统。构成配体-脂质体-多聚阳离子聚合物-DNA的复合物，促进反义寡核苷酸对靶基因的亲和力以及细胞膜的通透性，实现基因治疗的目的。 本论文主要包括以下内容： 1 反义寡核苷酸、聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸和肝靶向配体的合成。 采用适合批量生产的亚磷酰胺方法合成反义寡核苷酸(5′cga tgg cac ggc gca ctt 3′)。该合成方法简单，所得产物经高效液相纯化后纯度达到98％以上，UV、IR和MS鉴定，确认为目标化合物。在理化性质研究中，测定反义寡核苷酸油水分配系数为0.13；等电点为2.24～2.36；稳定性实验研究表明，光照条件和高温条件影响反义寡核苷酸的稳定性，应避光4℃保存。 均分子量为1000，2000和10000的聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸，通过酶连接和氧化还原反应，寡核苷酸的3′末端聚赖氨酸的偶联率为28～32％；反义寡核苷酸聚赖氨酸修饰物的杂交性质研究结果表明，与未修饰的反义寡核苷酸相比，聚赖氨酸修饰的反义寡核苷酸Tm值略有下降，但幅度不大，修饰后的反义寡核苷酸仍能形成稳定的杂交。 乳糖酸钠和硬酯胺为原料制备了配体N-十八酰乳糖胺(N-SLBA)，此方法简单易行，产物易于纯化。并应用IR、~1H-NMR、DSC和TG等方法对N-SLBA进行结构确证。 2 以反义寡核苷酸为模型药物，包封率为指标正交设计优化脂质体处方，并
论文目录:
缩略语表
中文摘要
ABSTRACT
材料
前言
第一章 反义寡核苷酸、聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸物与肝靶向配体的合成
第一节 反义寡核苷酸的合成与鉴定
一 方法和结果
1 反义寡核苷酸的合成
2 反义寡核苷酸的鉴定
2.1 反义寡核苷酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
2.1.1 工作液配制
2.1.2 反义寡核苷酸聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2 反义寡核苷酸毛细管电泳色谱分析
2.3 反义寡核苷酸结构确证
2.3.1 紫外光谱
2.3.2 红外光谱
2.3.3 质谱
3 反义寡核苷酸体外分析方法建立和处方前理化性质
3.1 反义寡核苷酸体外分析方法
3.1.1 色谱条件
3.1.2 标准曲线绘制
3.1.3 精密度和准确度
3.2 反义寡核苷酸处方前理化性质
3.2.1 反义寡核苷酸不同溶剂中溶解度
3.2.2 反义寡核苷酸油水分配系数
3.2.3 反义寡核苷酸等电点
3.2.3.1 试剂制备
3.2.3.2 实验操作
3.2.4 pH值、温度与光照强度对反义寡核苷酸水溶液化学稳定性的影响
二 讨论
第二节 不同长度聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸的合成
一 方法和结果
1 聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸的合成
1.1 工作液配制
1.2 反义寡核苷酸pCp偶联
1.3 反义寡核苷酸聚赖氨酸偶联
2 聚赖氨酸偶联率
2.1 考马斯亮蓝溶液
2.2 标准曲线
2.3 反义寡核苷酸聚赖氨酸偶联率
3 不同长度聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸的杂交性质
3.1 溶液配制
3.2 聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸的杂交
二 讨论
第三节 肝靶向配体N-十八酰乳糖胺合成
一 方法和结果
1 肝靶向配体N-SLBA合成
1.1 乳糖酸溶液制备
1.1.1 离子交换树脂处理
1.1.2 乳糖酸溶液制备
1.2 乳糖酸内酯制备
1.3 N-SLBA制备
2 肝靶向配体N-SLBA结构确证
2.1 N-SLBA的红外光谱
2.2 N-SLBA的~1H-NMR光谱
2.3 N-SLBA的DSC与TG图谱
3 N-SLBA性质
3.1 乳糖检测
3.1.1 标准曲线制备
3.1.2 乳糖酸定性检测
3.2 N-SLBA的亲水亲油平衡值(HLB)
3.3 乳糖酸的HLB值
二 讨论
本章小结
第二章 反义寡核苷酸制剂及其基本性质
第一节 反义寡核苷酸脂质体(CLO)
一 方法和结果
1 反义寡核苷酸脂质体制备
1.1 制备方法选择
1.2 薄膜分散法制备CLO的处方筛选
1.2.1 磷脂浓度对包封率的影响
1.2.2 介质种类及离子强度对包封率的影响
1.2.3 水相pH值对包封率的影响
1.2.4 水相含蔗糖类等物质对包封率的影响
1.2.5 药脂比对包封率的影响
1.2.6 磷脂与胆固醇比例对包封率的影响
1.2.7 挤出对包封率的影响
1.3 正交试验筛选与优化处方
2 反义寡核苷酸脂质体包封率测定
2.1 紫外分光光度法测定CLO中药物浓度
2.1.1 方法专属性
2.1.2 标准曲线
2.1.3 精密度
2.1.4 回收率
2.2 高效液相色谱法测定CLO中药物浓度
2.2.1 色谱条件
2.2.2 方法专属性
2.2.3 标准曲线和精密度
2.2.4 回收率
2.3 两种方法测定CLO中药物浓度的比较
2.4 超滤法分离CLO中的游离药物
2.4.1 空白回收率
2.4.2 加样回收率
二 讨论
第二节 反义寡核苷酸肝靶向脂质体(NLO)
一 方法和结果
1 脂质体中配体含量和加入方法
2 反义寡核苷酸肝靶向脂质体制备
二 讨论
第三节 聚赖氨酸修饰反义寡核苷酸的肝靶向脂质体
一 方法和结果
1 NLO-PLL1、NLO-PLL2和NLO-PLL3中游离药物浓度测定
1.1 方法专属性
1.2 标准曲线
1.3 精密度
1.4 回收率
2 脂质体和游离药物分离
2.1 葡聚糖凝胶柱
2.2 葡聚糖凝胶柱对空白脂质体吸附
3 反义寡核苷酸聚赖氨酸修饰物肝靶向脂质体制备和包封率测定
二 讨论
第四节 反义寡核苷酸制剂理化性质与稳定性
一 方法和结果
1 CLO、NLO、NLO-PLL1、NLO-PLL2和NLO-PLL3形态
2 CLO、NLO、NLO-PLL1、NLO-PLL2和NLO-PLL3粒径
3 脂质体ζ电位
4 CLO、NLO、NLO-PLL1、NLO-PLL2和NLO-PLL3稳定性
4.1 脂质体膜化学稳定性
4.2 物理稳定性
4.3 影响因素实验
4.4 留样观察实验
二 讨论
本章小结
第三章 肝靶向脂质体(NLO)体外和体内靶向性
第一节 HepG2细胞培养和生长曲线
一 方法和结果
1 HepG2细胞培养
1.1 试剂的配制
1.2 细胞复苏
1.3 细胞培养
2 HepG2细胞生长曲线
3 四唑法(MTT法)比色试验
二 讨论
第二节 磷脂浓度和培养时间对HepG2细胞摄取NLO影响
一 方法和结果
1 DiI标记NLO
2 脂质体浓度对HepG2细胞摄取影响
3 培养时间对HepG2细胞摄取NLO影响
4 结果的统计学处理
二 讨论
第三节 NLO对HepG2细胞靶向性
一 方法和结果
1 NLO对HpeG2细胞的细胞毒性
2 N-SLBA加入量对HepG2细胞亲和性影响
3 NLO靶向结合率
4 NLO对HepG2细胞摄取方式
二 讨论
第四节 肝靶向脂质体体内分布研究
一 方法和结果
1 生物样品荧光分析方法
1.1 生物样品处理
1.2 荧光分析方法的建立
1.3 标准曲线的绘制
1.4 精密度
1.5 方法回收率
2 NLO在小鼠体内组织分布
2.1 NLO在小鼠体内各组织分布
2.2 肝组织冷冻切片
2.3 NLO体内靶向性
二 讨论
本章小结
第四章 反义寡核苷酸肝靶向制剂对HepG2细胞生物活性研究
一 方法
1 试剂配制、细胞复苏和细胞培养
2 筛选测定脂质体对HepG2细胞细胞毒作用最佳试验条件
3 细胞形态学
4 细胞核Hoechst33258荧光染色
5 流式细胞分析法
6 免疫印迹法测定survivin蛋白(Western blot analysis)
6.1 工作液配制
6.2 胞浆提取物制备
6.3 蛋白质浓度测定
6.4 蛋白质电泳
6.5 免疫印迹
二 结果
三 讨论
本章小结
全文结论
参考文献
致谢
论文发表情况
发布时间: 2006-11-27
参考文献
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