糖皮质激素诱导的氧化应激对成骨细胞核心转录因子Cbfa1表达的影响

论文摘要

目的研究糖皮质激素诱导的氧化应激对成骨细胞核心转录因子Cbfal表达的影响,及N-乙酰半胱氨酸（NAC）的干预作用,以进一步探讨糖皮质激素性、骨质疏松发生的分子机制。方法1.用酶消化法分离培养新生24 h内大鼠颅骨成骨细胞,观察细胞形态、生物学特点,以碱性磷酸酶（ALP）染色和矿化结节染色鉴定成骨细胞。2.取第二代对数生长期细胞,接种时调细胞密度至每次实验所需的细胞密度,放入孵箱37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞贴壁换用无血清的培养液孵育24 h后,吸出无血清培养液按以下实验分组加入含不同药物浓度的培养液。随机将成骨细胞分为对照组、地塞米松（DEX） （0.01、0.1、1、10 umol/L）组、NAC （2 mmol/L）组、NAC+DEX （2 mmol/L NAC+10 umol/L DEX）组。用ALP染液进行ALP染色；茜素红染色法观察诱导分化第14d矿化结节的形成。3.用MTT法检测培养24 h、48 h和72 h细胞的增殖；醌衍生物比色法测定诱导分化第3d和第7dALP的活性；ELISA法测定诱导分化第3 d和第14d细胞上清液中骨钙素（BGP）的浓度；流式细胞仪检测培养2h、4h、8h、16h和24 h细胞内活性氧（ROS）；测定24 h细胞上清液中丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（T-AOC）;提取各组细胞的RNA,用RT-PCR法检测Cbfal的表达。结果1.各组MTT随培养时间延长OD值均呈增加趋势。在同一时间点,与对照组比较,NAC组OD值的变化无统计学意义；0.01 umol/L DEX组OD值升高（P＜0.05, P＜0.01）; DEX（0.1、1、10 umol/L）明显抑制成骨细胞的增殖（P＜0.01）。NAC+DEX组的OD值与10 umol/L DEX组相比,在各个时间点均增加（P<0.01）。2.在同一时间点,与对照组相比,NAC组ALP的活性和BGP的浓度变化无统计学意义,0.01umol/L DEX组ALP的活性和BGP的浓度升高（P＜0.05,P＜0.01）, DEX （0.1、1、10 umol/L）组ALP的活性和BGP的浓度降低（P＜0.05,P＜0.01）,NAC+DEX组的ALP的活性和BGP的浓度与10 umol/LDEX组相比,在各个时间点均增加（P＜0.05,P＜0.01）。3.在DEX （0.1、1、10umol/L）的作用下,与对照组相比,ROS和MDA产生增加,T-AOC能力降低（P＜0.05,P＜0.01）,NAC+DEX组与10 umol/L DEX组相比,ROS和MDA的水平下降,T-AOC能力升高（P<0.01）。4.在同一时间点,与对照组相比,NAC组相对Cbfal mRNA含量变化无统计学意义；0.01umol/L DEX上调Cbfal的表达（P＜0.01）;DEX（O.1、1、10umol/L）组Cbfal的表达被抑制（P<0.01）,NAC+DEX组与10umol/L DEX组比较,相对Cbfal mRNA含量升高（P<0.01）。结论DEX （0.1、1、10umol/L）通过诱导氧化应激下调成骨细胞核心转录因子Cbfal的表达,抑制成骨细胞的分化和功能,NAC可改善DEX对成骨细胞造成的氧化损伤。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 成骨细胞核心转录因子（Cbfa1）
• 1.1.1 Cbfa1的结构
• 1.1.2 影响Cbfa1活性和表达的信号转导途径及蛋白
• 1.1.3 Cbfa1在成骨细胞分化成熟和骨形成中的作用
• 1.1.4 Cbfa1参与调节成骨细胞的凋亡
• 1.2 糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）发生的分子机制
• 1.2.1 糖皮质激素（GC）对骨代谢的影响
• 1.2.2 GC诱导的氧化应激参与GIOP的发生
• 1.2.3 氧化应激对Cbfa1表达的影响
• 1.3 N-乙酰半胱氨酸（NAC）如何影响GIOP
• 1.3.1 NAC的抗氧化作用
• 1.3.2 NAC抑制细胞的凋亡
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验试剂和仪器
• 2.1.1 试剂和药物
• 2.1.2 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验细胞的制备
• 2.2.2 成骨细胞的鉴定
• 2.3 实验分组及检测指标
• 2.3.1 实验分组
• 2.3.2 检测指标
• 2.4 实验指标检测的原理和方法
• 2.4.1 成骨细胞增殖率的测定（MTT比色法）即四甲基偶氮唑蓝比色分析法
• 2.4.2 成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定
• 2.4.3 成骨细胞骨钙素（BGP）浓度测定
• 2.4.4 成骨细胞内活性氧（ROS）含量测定
• 2.4.5 成骨细胞培养上清液中总抗氧化力（T-AOC）、丙二醛（MDA）的测定
• 2.4.6 RT-PCR方法测定成骨细胞Cbfa1的表达
• 2.5 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 成骨细胞的生长与鉴定
• 3.1.1 成骨细胞的形态学观察
• 3.1.2 成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）染色
• 3.1.3 成骨细胞矿化结节染色
• 3.2 地塞米松（DEX）对成骨细胞的影响及N-乙酰半胱氨酸（NAC）的干预作用
• 3.2.1 DEX和NAC对成骨细胞增殖的影响
• 3.2.2 DEX和NAC对成骨细胞ALP活性的影响
• 3.2.3 DEX和NAC对成骨细胞BGP浓度的影响
• 3.2.4 DEX和NAC对成骨细胞Cbfa1表达的影响
• 3.2.5 DEX和NAC对成骨细胞ROS产生的影响
• 3.2.6 DEX和NAC对成骨细胞MDA和T-AOC的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 实验细胞——成骨细胞的分离、生物学特性及鉴定
• 4.2 地塞米松（0.1、1、10 umol/L DEX）通过诱导氧化应激下调Cbfa1的表达,抑制成骨细胞的分化和功能
• 4.2.1 DEX（0.1、1、10 umol/L）诱导氧化应激
• 4.2.2 DEX对成骨细胞Cbfa1表达的影响
• 4.2.3 DEX对成骨细胞增殖和分化的影响
• 4.3 N-乙酰半胱氨酸（NAC）可减弱DEX对成骨细胞的氧化应激损伤
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 中英文术语缩写字表