论文摘要
原发性脑肿瘤每年约有新发病例22500例，约占所有新发肿瘤的1.4%,以及所有癌症相关死亡率的2.3%。胶质细胞瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，其发病率占所有脑肿瘤的70%，根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）病理诊断,将其分为低级别胶质细胞瘤（WHO1级和2级）和高级别胶质细胞瘤（WHO3级和4级）。尽管近年来对于胶质细胞瘤的治疗手段，包括手术、放射治疗和化学治疗已取得了长足的进展，但是该类肿瘤患者的总体生存期仍较短。低级别胶质细胞瘤的5年生存率根据其组织学类型不同，一般为30-70%，而恶性程度最高、也是最常见的胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）的中位生存期仅为1215个月。胶质细胞瘤患者的预后常受多因素的影响，WHO病理级别是公认的最重要的相关因素，但在同一级别内不同患者的生存期也存在很大的差异，主要原因可能为不同患者肿瘤特异性的生物学行为的差别。因此，探寻潜在的肿瘤生物学标记物，在WHO病理级别的基础上，对胶质细胞瘤进行更加准确的预后评估，进而对患者施行分类，指导临床治疗方案的选择，则是未来肿瘤生物学治疗的一大方向。肿瘤的发生和发展除了受经典遗传学机制调控外，表观遗传学修饰的作用日益受到研究界的重视。表观遗传学被定义为非脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）序列改变而引起的可遗传的基因表达改变。它的主要机制包括、但不局限于：基因启动子异常甲基化、组蛋白修饰及小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）。最广为人知的表观遗传学修饰是基因启动子甲基化，即启动子区CpG岛的超甲基化可诱导靶基因的沉默，从而参与调控细胞周期、DNA修复、致癌物的代谢、细胞间相互作用、凋亡、血管生成等肿瘤生物学行为，并可同各种遗传学改变共同作用，参与肿瘤的发生与进展。除了DNA启动子超甲基化，全局性组蛋白修饰能够影响整个基因组的结构和完整性，进而破坏正常细胞的基因表达模式，参与肿瘤发生的过程。胶质细胞瘤的侵袭和转移常使患者的治疗颇为棘手，是引起肿瘤复发和导致不良预后的主要原因。胶质细胞瘤组织通常由瘤组织和间质组织共同构成，这种明显的组织异质性导致了常见的根据病理级别判定的预后和实际临床预后间的不一致性。表观遗传学研究可为现行的病理分级提供更多的辅助信息，包括确立辅助预后判断的标记分子。基因启动子甲基化已在包括胶质细胞瘤在内的多种实体肿瘤及恶性血液病中被证实具有作为早期诊断、指导治疗和预后判断的分子标记物的潜能。本课题分别从基因启动子甲基化和组蛋白修饰的两个方面，探究人脑胶质细胞瘤中的表观遗传学改变，进一步探讨其在神经系统胶质细胞瘤的预后判断及化疗方案选择中的临床意义。1恶性胶质细胞瘤组织、血清、脑脊液样本中多基因启动子超甲基化及其临床意义已有研究证实，多个肿瘤抑制基因的启动子异常超甲基化参与了人脑胶质细胞瘤的恶性进展。同时，在多种实体肿瘤包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌的研究中发现，这些患者的体液DNA中启动子超甲基化都能作为早期诊断和预后判断的肿瘤标记物。因此，我们对恶性胶质细胞瘤患者的肿瘤组织、血清和脑脊液中基因启动子甲基化状态进行了定量检测，并分析其与此类肿瘤患者的预后判断的相关性。通过甲基化DNA免疫共沉淀（Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）结合实时定量聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction，qPCR）的方法，定量研究了在肿瘤发生与进展的不同环节中分别发挥重要作用的4个基因,即：DNA修复基因6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）、细胞周期调节子p16INK4a、肿瘤转移抑制基因组织金属蛋白酶抑制因子-3（Tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）和血管生成抑制基因血小板反应蛋白1（Thrombospondin1，THBS1）的启动子分别在66例恶性胶质细胞瘤患者的肿瘤组织、血清及脑脊液样本中的甲基化水平。同时选取了年龄匹配的20例非肿瘤患者的血浆及脑脊液样本作为对照。结果表明，MGMT、p16INK4a、TIMP-3和THBS1基因在胶质细胞瘤患者的肿瘤组织、血清及脑脊液样本中均有较高比例的启动子超甲基化，而对照样本中未发现其超甲基化；且血浆及脑脊液样本中各个基因启动子的超甲基化趋势均与对应的肿瘤组织相一致（Pearson’s相关系数，r值范围0.3490.963，P <0.0001），特异性为100%。肿瘤组织和脑脊液中MGMT启动子超甲基化，肿瘤组织、血清和脑脊液中p16INK4a启动子超甲基化，肿瘤组织中TIMP-3启动子超甲基化，和肿瘤组织中THBS1启动子超甲基化，均与WHO级别呈正相关（Spearman’s相关系数，r值范围0.2970.422，P≤0.015）。通过最大化卡方检验（Maximal χ2method）计算出MGMT、p16INK4a、TIMP-3、THBS1这4个基因启动子分别在肿瘤组织、血清和脑脊液的甲基化水平的临界值。临界值能够按生存期差异最大化的原则，将所有病例分成预后良好和不良两组。除了脑脊液中TIMP-3启动子超甲基化与较好的预后相关之外，MGMT、p16INK4a、THBS1基因在肿瘤组织、血清和脑脊液中的启动子低甲基化均与较好的预后相关。Cox回归模型分析独立预后因素，结果显示：血清样本中的MGMT、p16INK4a和THBS1基因启动子的超甲基化与较差的总生存期相关；而脑脊液样本中的MGMT和THBS1基因启动子的超甲基化则为无进展生存期的不良预后指标。本研究发现对多个基因启动子超甲基化的检测可作为胶质细胞瘤的预后判断指标，而血液及脑脊液中的循环DNA超甲基化的水平可作为微创的肿瘤分子标记物。此外，脑肿瘤患者多基因启动子超甲基化的检测对原发性肿瘤的早期诊断、最佳治疗方案的选择、肿瘤复发进展的监测和治疗反应的评估均具有潜在的临床意义。在此研究结果基础上，采用基因芯片的手段进一步明确包括MGMT在内的化疗药物代谢调控网络，将有助于根据患者的表观遗传学表达谱进行最适化疗方案的选择，实现胶质细胞瘤患者的个体化治疗。2胶质细胞瘤全局性组蛋白修饰及其临床意义全局性组蛋白修饰作为潜在的预后判断的分子标记物，已在前列腺癌、非小细胞肺癌和消化道腺瘤中得到证实，而迄今尚未有其在胶质细胞瘤中的相关报道。因此，我们进一步研究了染色体中多个位点组蛋白修饰这一表观遗传学改变对于脑胶质细胞瘤患者的预后判断的意义。在230例不同级别胶质细胞瘤患者的组织样本中，通过免疫组织化学染色检测了7个组蛋白修饰位点的表达水平，包括组蛋白H3赖氨酸-4二甲基化（Histone3lysine4dimethylation，H3K4diMe）、组蛋白H4精氨酸-3单甲基化（Histone4arginine3monomethylation，H4R3monoMe）、组蛋白H4赖氨酸-20三甲基化（Histone4lysine20trimethylation，H4K20triMe）、组蛋白H3赖氨酸-9乙酰化（Hhistone3lysine9acetylation，H3K9Ac）、组蛋白H3赖氨酸-18乙酰化（Histone3lysine18acetylation，H3K18Ac）、组蛋白H4赖氨酸-12乙酰化（Histone4lysine12acetylation，H4K12Ac）和组蛋白H4赖氨酸-16乙酰化（Histone4lysine16acetylation，H4K16Ac）。并采用了递归分割（Recursive partitioning analysis，RPA）的统计学方法对结果进行分析。组蛋白修饰H3K4diMe、H4R3monoMe、H4K20triMe、H3K9Ac、H3K18Ac、H4K12Ac和H4K16Ac的中位阳性表达率分别为：63%、60%、75%、74%、78%、65%和68%。其中H3K4diMe、H4R3monoMe、H3K9Ac、H3K18Ac、H4K12Ac和H4K16Ac表达水平的变化间均存在明显的相关性（Pearson’s相关系数，r值范围0.2050.528，P≤0.028）。H3K4diMe、H4R3monoMe、H3K9Ac和H4K12Ac的高表达与WHO级别正相关（Spearman’s相关系数，r值范围0.1930.328，P≤0.039）。RPA将这230例患者基于其WHO级别、肿瘤组织学类型和组蛋白修饰水平（H3K9Ac阳性细胞百分率<88%或≥88%, H3K4diMe阳性细胞百分率<64%或≥64%, H3K18Ac阳性细胞百分率<74%或≥74%，H4K20triMe阳性细胞百分率<75%或≥75%）分成10个RPA预后组。这10个预后组间的总生存期和无进展生存期均存在显著的统计学差异（P <0.0001）。进一步用Cox模型纳入多个可能的预后因素，包括年龄、性别、WHO级别、肿瘤的组织学类型、手术切除程度、Karnofsky功能状态评分和RPA预后组，进行回归分析，发现仅有年龄和RPA分组为影响总生存期的独立风险因素；且RPA分组是无进展生存期的唯一风险因素。上述结果显示组蛋白修饰水平与胶质细胞瘤患者的预后相关，提示组蛋白修饰水平结合WHO病理诊断能对患者的恶性程度进行更准确的分级。同时，随着组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为新型化疗药进入临床试验，组蛋白修饰有可能作为指导化疗选择的分子标记物，但有待于进一步研究加以证实。本研究结果证明，对组蛋白修饰和DNA甲基化的联合检测，将会为胶质细胞瘤的诊断提供更全面的表观遗传学修饰信息。此两项指标的结合有望作为重要的生物学预后因素对肿瘤患者的化疗敏感性进行预判，为进行肿瘤个体化治疗方案的选择提供依据。
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