论文摘要
Vpr是由人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）编码的辅助蛋白。Vpr蛋白在病毒感染晚期表达,通过与Gagp6直接相互作用被包装到病毒颗粒中。Vpr在HIV-1复制及致病性等方面发挥重要作用,特别是能够在病毒感染早期改变细胞环境,使之有利于病毒复制。vpr基因的缺失会导致病毒复制能力显著下降。Vpr具有多种功能,包括可调节细胞NF-κB在内的多条信号通路,但Vpr对NF-κB信号通路的确切作用及其中的分子机制尚不明确。本文对Vpr与NF-κB信号通路的关系展开研究,获得相关实验数据如下：1.证实Vpr可同时激活NF-kB经典和非经典信号通路：发现在HIV-1感染早期,病毒颗粒包装的Vpr能增强IκBα的磷酸化；同时,Vpr可以促进p65磷酸化及入核并最终激活NF-κB报告基因；过表达Vpr及病毒颗粒携带的Vpr均能引起p100的磷酸化,促进p100剪切为p52,从而活化非经典通路。2.Vpr与NF-κB经典和非经典信号通路上游的IKKα和IKKβ存在相互作用,并调节二者的磷酸化；利用RNA干扰技术下调细胞内源p65、RelB、IKKα及IKKP的表达,发现Vpr对NF-κB信号通路的激活作用明显减弱。3.通过免疫共沉淀实验对IKK复合物上游关键调节因子的筛选,发现Vpr与TRAF6及TAK1在体内存在相互作用,不与TRAF2及TAB1相互作用。但Vpr并不能影响TRAF6的自身泛素化。过表达和病毒感染两个层面均证实Vpr可在多种细胞中增强TAK1第187位苏氨酸（Thr187）的磷酸化,导致底物蛋白IKKα、IKKβ及MKK7的磷酸化,进而活化下游信号通路；同时,Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TAB1及TRAF6;此外,Vpr通过募集TAB3促进TAK1的泛素化。4.对Vpr活化NF-κB信号通路后对自身功能的影响进行初探：在NF-κB信号通路关键蛋白下调的细胞系中,检测Vpr对HIV-1LTR的激活作用,结果表明,Vpr介导的NF-κB活化促进了其对LTR的激活作用；进一步通过流式细胞术分析了Vpr在这些细胞系中诱导细胞周期G2/M期停滞的能力,初步证明NF-κB信号通路的激活有助于Vpr行使细胞周期停滞功能。综上所述,本文证实了HIV-1感染宿主细胞早期,Vpr能够激活细胞内NF-κB经典和非经典信号通路,并初步阐明其中的分子机制：Vpr一方面通过增强IKKα及IKKβ的磷酸化,另一方面通过结合并增强TAK1的活性,共同实现了“劫持”NF-κB信号通路的目的,并促进自身LTR的转录、引起细胞周期停滞在G2/M期,从而有利于病毒的复制。
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摘要Abstract目录第一章 引言第一节 人类免疫缺陷病毒（HIV）简介1.1.1 HIV-1病毒颗粒概况1.1.2 HIV-1基因组结构及其功能1.1.2.1 长末端重复序列LTR1.1.2.2 结构基因及其产物1.1.2.3 调控基因及其产物1.1.2.4 辅助基因及其产物1.1.3 HIV-1基因表达调控1.1.3.1 宿主转录因子的调节1.1.3.2 细胞因子的调节1.1.3.3 自身编码蛋白的调节1.1.3.4 超感染病毒蛋白的调节1.1.3.5 表观遗传的调节第二节 Vpr蛋白研究进展1.2.1 Vpr蛋白概述1.2.2 Vpr蛋白的结构1.2.3 Vpr蛋白的功能2/M期停滞'>1.2.3.1 诱导细胞周期G2/M期停滞1.2.3.2 反式激活HIV-1 LTR及宿主基因的表达1.2.3.3 诱发细胞凋亡1.2.3.4 促进反转录过程的保真性1.2.3.5 促进前整合复合物入核第三节 NF-κB信号通路1.3.1 NF-κB信号通路的组成1.3.1.1 NF-κB因子1.3.1.2 IκB（NF-κB抑制蛋白）1.3.1.3 IKK（IκB kinase）1.3.2 NF-κB信号通路简介1.3.2.1 NF-κB经典通路1.3.2.2 NF-κB非经典通路1.3.2.3 NF-κB信号通路的负调节1.3.3 病毒与NF-κB信号通路的关系1.3.3.1 病毒激活NF-κB信号通路1.3.3.2 病毒抑制NF-κB信号通路第四节 AP-1信号通路1.4.1 转录因子AP-11.4.2 AP-1信号通路简介1.4.3 病毒与AP-1信号通路的关系第五节 TAK1蛋白1.5.1 TAK1简介1.5.2 TAK1活性的调节1.5.2.1 TAK1的磷酸化1.5.2.2 TAK1的泛素化1.5.2.3 TAK1活性的负调节1.5.3 病毒与TAK1的关系第六节 本研究的目的和意义第二章 材料与方法第一节 实验材料2.1.1 细胞2.1.2 菌株2.1.3 质粒2.1.3.1 本文构建的质粒2.1.3.2 本文用到的其他质粒2.1.4 药物2.1.5 主要试剂2.1.5.1 克隆操作所用酶类及试剂2.1.5.2 抗体2.1.5.3 其他试剂第二节 实验方法2.2.1 基因操作2.2.1.1 引物设计及合成2.2.1.2 聚合酶链式反应（PCR）2.2.1.3 DNA的酶切和连接2.2.1.4 E.coli感受态细胞的制备和转化2.2.1.5 质粒DNA提取2.2.1.6 测序2.2.2 蛋白表达和包涵体分离2.2.3 多克隆抗体制备及效价测定2.2.3.1 免疫小鼠2.2.3.2 抗体效价测定2.2.3.3 抗血清收集2.2.4 细胞相关实验2.2.4.1 细胞培养2.2.4.2 细胞转染2.2.4.3 THP-1的诱导分化2.2.5 荧光素酶活性测定（Luciferase assay）2.2.6 免疫印迹（Western Blotting）2.2.6.1 细胞裂解液制备2.2.6.2 SDS-PAGE2.2.6.3 转膜2.2.6.4 杂交2.2.7 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）2.2.8 免疫荧光分析（Immunofluorescence assay,IFA）2.2.8.1 IFA相关试剂2.2.8.2 IFA实验步骤2.2.9 流式细胞术（Fluorescence-Activated Cell Sorting,FACS）2.2.10 RNA干扰实验（RNAi）2.2.10.1 RNAi质粒的构建2.2.10.2 shRNA反转录病毒的包装2.2.10.3 稳定表达shRNA细胞系的构建2.2.11 病毒相关实验2.2.11.1 反转录病毒颗粒的制备2.2.11.2 HIV-1 p24抗原的检测2.2.11.3 病毒感染2.2.12 统计学分析第三章 结果与分析第一节 HIV-1 Vpr通过IKKα及IKKβ激活NF-κB信号通路3.1.1 HIV-1 Vpr激活细胞NF-κB经典通路3.1.1.1 Vpr能够激活NF-κB报告基因3.1.1.2 病毒颗粒携带的Vpr增强IκBα的磷酸化3.1.1.3 过表达Vpr引起IκBα的磷酸化3.1.1.4 Vpr促进p65的磷酸化及入核3.1.1.5 Vpr活化NF-κB信号通路需要p65的参与3.1.2 Vpr能够激活NF-κB非经典通路3.1.2.1 Vpr增强p100磷酸化3.1.2.2 Vpr促进p100的剪切3.1.2.3 Vpr活化NF-κB信号通路依赖细胞内源的RelB3.1.3 Vpr与IKKα和IKKβ存在相互作用并调节其激酶活性3.1.3.1 Vpr与IKKα和IKKβ存在相互作用3.1.3.2 Vpr增强IKKα和IKKβ的磷酸化3.1.3.3 IKKα和IKKβ是Vpr激活NF-κB信号通路的关键第二节 HIV-1 Vpr通过调节TAK1的活性激活NF-κB信号通路3.2.1 Vpr增强TAK1的磷酸化3.2.1.1 Vpr能激活AP-1报告基因3.2.1.2 Vpr促进TAK1 Thr187的磷酸化3.2.1.3 Vpr激活NF-κB/AP-1信号通路需要TAK1的磷酸化3.2.1.4 Vpr与TAK1而非TAB1存在相互作用3.2.1.5 Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TAB13.2.2 Vpr参与调节TAK1泛素化的初步研究3.2.2.1 Vpr增强TAK1的泛素化3.2.2.2 Vpr与TRAF6而非TRAF2相互作用3.2.2.3 Vpr不影响TRAF6的自身泛素化3.2.2.4 Vpr对TAK1的磷酸化依赖于TRAF63.2.2.5 Vpr增强TAB3与TAK1的结合3.2.2.6 Vpr磷酸化TAK1需要TAK1被泛素化第三节 Vpr激活NF-κB信号通路对自身功能的影响3.3.1 Vpr点突变激活NF-κB及HIV-1 LTR的能力3.3.2 Vpr激活HIV-1 LTR依赖于NF-κB信号通路2/M期停滞的能力'>3.3.3 Vpr点突变诱导细胞周期G2/M期停滞的能力3.3.4 NF-κB信号通路的活化对Vpr行使细胞周期停滞功能的影响第四章 讨论第一节 Vpr可在病毒感染早期激活NF-κB信号通路第二节 Vpr通过调节IKK复合物的活性激活NF-κB信号通路第三节 Vpr可调节TAK1的活性第四节 Vpr介导NF-κB信号通路活化的效应4.4.1 Vpr活化NF-κB信号通路对病毒复制的影响4.4.2 Vpr活化NF-κB信号通路对细胞的影响第五章 结论与展望第一节 结论第二节 展望参考文献致谢附录 英文缩写个人简历在学期间发表的学术论文与研究成果
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HIV-1 Vpr激活细胞NF-κB信号通路分子机制的研究
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