论文摘要
人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是一种嗜黏膜和皮肤上皮的双链DNA病毒,属于乳头瘤病毒科,乳头瘤病毒属。HPV感染与多种疾病的发生相关,根据致病性将其分为高危型和低危型2种,高危型感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关,有：HPV-16、-18、-45、-31、-33、-52、-58等；其中70%的宫颈癌与HPV-16/18型有关。低危型感染与生殖器疣和宫颈低级鳞状上皮增生病变的发生密切相关,有：HPV-6、-11、-40、-42等,其中6和11型的感染与90%以上的生殖器疣和宫颈低级鳞状上皮增生病变的发生密切相关。大量研究证实HPV感染是宫颈癌发生的主要原因。随着病因学研究的深入,以病原学为基础的HPV预防性疫苗的研发成为热点,到90年代后期取得了突破性进展,2006年终于成功上市。目前两种可用的预防性HPV疫苗的抗原都是由重组的HPV Ll衣壳蛋白组成的VLPs。四价疫苗（Gardasil）由Merch &Co.生产,含有酵母表达的HPV-6,HPV-11, HPV-16, HPV-18四种VLPs。二价疫苗（Cervarix）是由GSK生产含有昆虫细胞中表达的HPV-16, HPV-18两种VLP蛋白。大量的临床试验已经表明这两种疫苗都有良好的耐受性、免疫原性和有效地抗HPV感染和宫颈癌前病变。如果广泛使用目前针对HPV-16和HPV-18的HPV疫苗,将会极大地降低宫颈癌的发生率。然而,约83%的宫颈癌发生在发展中国家,全球实施现在许可的疫苗花费太高,而不能使最需要使用疫苗的人群受益。并且,宫颈癌还有约30%是不在现有的HPV疫苗的保护之列。因此,价格低廉、广谱的新型预防性HPV疫苗的研发对HPV感染相关疾病的预防起着至关重要的作用。L2作为HPV的次要衣壳蛋白,虽然不是形成衣壳所必须的,但已有诸多研究表明其N端可诱发产生具有交义中和活性的抗体。本试验的主要研究目的就是以L2蛋白为靶抗原,探索研制一种低廉、广谱的HPV预防性疫苗。本论文的设计思路是：根据流行病学资料选择主要流行型别,高危型HPV-16,-18,-58型；低危型HPV-6,-11型,将各型别L2 N端具有交叉中和活性的区域作为靶抗原,以高危型和低危型分为两组将对应基因串联,构建三价和二价融合基因片段。在原核表达系统中表达纯化三价、二价融合蛋白,评价其诱发中和抗体和交叉中和抗体的能力。期望在此基础之上构建能够诱发强的的广谱交叉中和抗体的五价融合蛋白,为研制具有广谱交叉中和保护能力、价格低廉的HPV预防性疫苗做一些前期的探索。主要研究结果如下：第一、构建了HPV低危型HPV-6,-11不同表位排列组合的二价融合的原核表达质粒三个。质粒转化的BL21（DE3+）菌在IPTG诱导下能表达相应分子量的目的蛋白,经Western-Blot鉴定正确。将纯化的纯度在90%以上的三种二价融合蛋白分别与A1（OH）3佐剂混合免疫雌性BALB/c小鼠。用ELISA和基于假病毒的体外中和试验评价免疫效果。ELISA结果显示,三种不同长度的HPV-6/11型L2二价融合蛋白有特异性ⅠgG抗体产生,同型别滴度在1：10000-1：200000之间,交叉ⅠgG滴度为1：3200到1：51200之间。中和试验结果显示,对于HPV-6,HPV-11假病毒颗粒,滴度在1：400到1：800之间,而假病毒HVP-16,-18,-45,-52,-58也有不同程度的中和滴度,最高可达1：800。第二、将低危型HPV-6/11（11-88氨基酸/11-88氨基酸）二价融合蛋白与本室已经构建好的高危型HPV-18/16/58（11-200氨基酸/11-150氨基酸/11-150氨基酸）三价融合蛋白混合免疫。ELISA结果显示,混合免疫产生的特异性ⅠgG抗体,滴度都在1：10000-1：200000之间。中和试验结果显示,同型中和滴度都在1：400到1：3200之间,交叉中和抗体HPV45和HPV52分别为1：800,1：400。将筛选出的低危型HPV-6/11（11-88氨基酸/11-88氨基酸）二种型别融合基因片段与本室已构建好的高危型HPV-18/16/58三种型别基因片段列串联构建五种型别融合的原核表达质粒二个。一个是高危型（pET-HPV 18/16/58/6/11）在N端,一个是低危型（pET-HPV 6/11/18/16/58）在N端。将质粒转化的BL21（DE3+）菌在IPTG诱导下能表达相应分子量的目的蛋白,经Western-Blot鉴定正确。将纯化的纯度在90%以上的两种五价融合蛋白分别与Al（OH）3佐剂混合免疫雌性小鼠。用ELISA和基于假病毒的体外中和试验评价免疫效果。ELISA结果显示,二者的ⅠgG抗体滴度都在1：51200到1：204800之间。中和试验结果显示,蛋白HPV-6/11/16/18/58针对同型别除了HPV11的中和抗体滴度为1：800之外其它的中和抗体滴度为1：6400,而对于交叉型别HPV-45, HPV-52的中和滴度都是1：3200。比单独二价（HPV6/11）、三价（HPV-18/16/58）及二价、三价混合免疫产生的中和抗体滴度都高,就本研究所能检测人HVP各型别中和抗体滴度而言,蛋白HPV-18/16/58/6/11诱发产生的交叉中和抗体比蛋白HPV-6/11/18/16/58高。综上所述,本研究筛选出的两种低危型HPV L2基因片段串联表达的融合蛋白能够诱发针对同型别的中和抗体,及较低滴度的交叉中和抗体。将该基因片段与三价高危型HPV融合基因片段串联构建表达的五种基因型HPV融合蛋白能诱导产生针对同型别除了HPV11的中和抗体滴度为1：800之外其它的中和抗体滴度为1：6400,而对于交叉型别HPV-45,HPV-52的中和滴度都是1:3200。这为研发具有广谱交叉中和活性的新型HPV疫苗,提供了有价值的实验资料。