根癌农杆菌介导的PEAMT基因转化菊花的研究

论文摘要

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是中国的传统名花,也是世界上最重要的观赏花卉之一。地被菊是菊花适于陆地栽培的一个品种群,其花色丰富,观赏性好,覆盖能力强,具有广阔的应用前景。但由于城市水资源的缺乏和盐渍化的日益严重,限制了地被菊的推广。通过根癌农杆菌介导的方法,将甜菜碱合成相关酶的基因PEAMT转入地被菊基因组中,培育出抗逆性更强的新品种,对地被菊在全国大面积推广,更好的为园林绿化服务具有重要意义。本研究获得的主要结果如下:1、建立了地被菊品种‘玉人面’、‘铺地金’的转化受体系统。以MS为基本培养基,采用6-BA和NAA两种激素9种不同配比的组合,从10个地被菊品种中筛选出‘玉人面’、‘铺地金’和‘北林红’3个高频再生品种,再生率分别为98%、96%和96%;‘玉人面’的再生培养基为:MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L;‘铺地金’的再生培养基为:MS+6-BA2mg/L+NAA1mg/L;‘北林红’的再生培养基为:MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L。同时还研究了不同的外植体类型,继代次数对再生的影响,叶片再生能力最高,但随着继代次数的增加,部分品种叶片再生能力有下降的趋势。研究了‘玉人面’和‘铺地金’对抗生素Kan的敏感性,结果表明7.5mg/L的Kan是菊花品种‘玉人面’叶片外植体筛选培养的临界耐受浓度,10mg/L的Kan是‘铺地金’叶片筛选培养的临界浓度;培养基中浓度为250mg/L的头孢霉素能够很好的抑制农杆菌的生长,且没有影响叶片外植体的再生率和不定芽数,可作为‘玉人面’和‘铺地金’的抑菌性抗生素。2、建立了地被菊‘玉人面’的遗传转化体系:以预培养12h的叶片为转化材料,用浓度OD600为0.4的携带有PEAMT基因的农杆菌菌液侵染10min,24℃共培养2d,延迟培养4d,用选择压为7.5mg/L的Kan连续筛选直至有不定芽生成。待不定芽长至1cm左右时转入附加20mg/L Kan的1/2MS生根培养基中,继续筛选,并对生根抗性植株进行了PCR和Southern blotting检测,103株生根抗性苗中,有9株呈PCR阳性反应,获得特异性扩增条带,其中4个被检植株产生Southern杂交信号,证明PEAMT基因已整合到地被菊基因组中,外源基因主要是单拷贝插入。3、从转入PEAMT基因的‘玉人面’株系中,选取生长正常的4个株系及非转

论文目录

• 缩写词及中文对照
• 摘 要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 菊花基因工程研究进展
• 1.2.1 中国菊花的发展历史
• 1.2.2 国内外菊花育种的发展趋势
• 1.2.3 菊花基因转化方法
• 1.2.4 菊花基因转化受体系统的研究
• 1.2.4.1 菊花再生体系的研究
• 1.2.4.2 菊花对抗生素的敏感性研究
• 1.2.4.3 菊花对不同菌株的敏感性研究
• 1.2.4.4 外界因素对转化效果的影响
• 1.2.5 菊花转基因研究进展
• 1.2.5.1 改变菊花花色的基因工程
• 1.2.5.2 改变菊花花型和株型的基因工程
• 1.2.5.3 改变菊花花期的基因工程
• 1.2.5.4 提高菊花抗病虫能力的基因工程
• 1.2.5.5 提高菊花抗旱、耐盐和低温胁迫的基因工程
• 1.3 植物甜菜碱合成相关酶的基因工程研究进展
• 1.3.1 植物抗非生物胁迫（如低温、干旱、盐碱等）基因
• 1.3.2 甜菜碱的生物合成
• 1.3.3 植物甜菜碱合成相关酶的基因工程
• 1.3.3.1 磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因（PEAMT）
• 1.3.3.2 胆碱单加氧酶基因（CMO）
• 1.3.3.3 甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）
• 1.4 基因工程中存在的的问题
• 1.4.1 提高转化率
• 1.4.2 提高对外源基因表达的调控能力
• 1.5 本课题研究的主要内容和技术路线
• 1.5.1 主要内容
• 1.5.2 技术路线
• 2 菊花基因转化受体系统的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 生化试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菊花无菌苗体系的建立
• 2.2.2 6-BA 和NAA 不同浓度配比对菊花品种叶片外植体再生的影响
• 2.2.3 同一品种不同外植体不定芽再生能力的比较
• 2.2.4 不同继代培养时间对菊花叶片形态发生能力的影响
• 2.2.5 菊花无菌苗的继代增殖
• 2.2.6 卡那霉素选择压力的确定
• 2.2.7 卡那霉素对菊花无菌苗生根的影响
• 2.2.8 抗生素 Cef 对农杆菌的抑菌试验
• 2.2.9 数据统计与分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同灭菌时间对外植体启动培养的影响
• 2.3.2 6-BA 和NAA 不同浓度配比对菊花品种叶片外植体再生的影响
• 2.3.3 同一品种不同外植体不定芽再生能力的比较
• 2.3.4 不同继代培养时间对菊花叶片外植体再生能力的影响
• 2.3.5 不同培养基对菊花增殖培养的影响
• 2.2.6 卡那霉素选择压力的确定
• 2.3.7 卡那霉素对菊花无菌苗生根的影响
• 2.3.8 抗生素 Cef 对农杆菌的抑菌试验
• 2.4 结论与讨论
• 2.4.1 菊花高效再生体系的建立
• 2.4.2 抗生素种类和浓度的选择
• 3 菊花转 PEAMT 基因遗传转化体系的建立
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 根癌农杆菌菌株及载体
• 3.1.3 分子生物学试剂及缓冲液试剂的配制
• 3.1.4 主要仪器和设备
• 3.1.5 培养基及添加成分
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 根癌农杆菌的活化及工程菌液的制备
• 3.2.2 预培养时间的确定
• 3.2.3 农杆菌侵染浓度和时间的确定
• 3.2.4 共培养时间的确定
• 3.2.5 延迟培养时间的确定
• 3.2.6 生根培养
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 预培养对菊花遗传转化的影响
• 3.3.2 菌液浓度和侵染时间对菊花转化效果的影响
• 3.3.3 共培养时间对菊花遗传转化的影响
• 3.3.4 延迟培养时间对菊花遗传转化的影响
• 3.4 结论
• 4 菊花转 PEAMT 基因植株的获得
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂药品
• 4.1.3 转基因菊花的 PCR 检测
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒 DNA 的提取
• 4.2.1.1 碱法小量提取质粒DNA
• 4.2.1.2 质粒小提中量试剂盒提取质粒DNA
• 4.2.2 植物基因组 DNA 的提取
• 4.2.2.1 CTAB 小量法提取菊花基因组 DNA
• 4.2.2.2 植物基因组DNA 试剂盒提取DNA
• 4.2.3 PCR 检测
• 4.2.4 Southern-blotting 检测
• 4.2.4.1 试剂配制
• 4.2.4.2 探针的制备
• 4.2.4.3 标记探针的检测
• 4.2.4.4 植物基因组的酶切与琼脂糖凝胶电泳
• 4.2.4.5 DNA 的转膜和固定
• 4.2.4.6 杂交
• 4.2.4.7 洗膜
• 4.2.4.8 免疫检测
• 4.2.5 转基因菊花叶片在筛选培养基上再生能力鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转 PEAMT 基因植株的 PCR 检测
• 4.3.2 PCR 阳性植株的Southern-blotting 分析
• 4.3.3 转基因‘玉人面’叶片在筛选培养基上再生能力鉴定
• 4.4 结论与讨论
• 5 地被菊转 PEAMT 基因植株的耐盐性分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料及处理
• 5.1.2 甜菜碱的提取、纯化和含量测定
• 5.1.2.1 甜菜碱的提取
• 5.1.2.2 甜菜碱的纯化
• 5.1.2.3 液相色谱测定条件
• 5.1.2.4 甜菜碱的鉴定及定量
• 5.1.2.5 甜菜碱的标准曲线
• 5.1.3 叶绿素荧光参数的定义与测定
• 5.1.3.1 叶绿素荧光参数的定义
• 5.1.3.2 叶绿素荧光参数的测定
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 转基因株系在盐胁迫处理后甜菜碱含量的动态变化
• 5.2.2 转基因株系在盐胁迫处理后甜菜碱增量的差异
• 5.2.3 不同盐浓度胁迫下转基因株系甜菜碱含量的比较
• 5.2.4 150mmol/L 盐胁迫对转基因株系和对照叶绿素荧光参数的影响
• 5.2.5 盐胁迫处理对转基因株系高生长的影响
• 5.2.6 转基因株系与对照在盐胁迫处理后盐害指数及耐盐性比较
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转基因株系和对照在盐胁迫处理后甜菜碱含量的动态变化
• 5.3.2 转基因株系在盐胁迫处理后甜菜碱增量的差异
• 5.3.3 不同盐浓度胁迫下转基因株系与对照甜菜碱含量的比较
• 5.3.4 150mmol/L 盐胁迫对转基因株系和对照叶绿素荧光参数的影响
• 5.3.5 盐胁迫处理对转基因株系高生长的影响
• 5.3.6 转基因株系与对照在盐胁迫处理后盐害指数及耐盐性比较
• 5.4 结论与讨论
• 6 主要结论和研究展望
• 6.1 主要结论和创新点
• 6.2 研究展望
• 参考文献
• 附录 A 试剂
• 附录 B 常用缓冲液及培养基配方
• 个人简历
• 导师简介
• 致谢
• 博硕士论文同意发表的声明