论文摘要
β2-微球蛋白（β2-microglobulin, β2m）由Berggard于1968年首次从肾小管病变患者的蛋白尿中分离出来,是一种非糖基化小分子蛋白,所有有核细胞均可合成。研究证实,β2m作为主要相容性复合体I（major histocompatibility complex, MHC）类分子的恒定链（轻链）,对MHC-I类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。β2m的功能研究发现,在人类一些肿瘤中,β2m与肿瘤的生存、侵袭、凋亡,甚至转移有关。虽然β2m为肿瘤治疗靶位以及致肿瘤机制的深入研究提供了新的途径,但p2m在肿瘤中的生物学功能目前仍不十分清楚。马立克氏病（Marek’s Disease, MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s Disease virus,MDV）引起的一种鸡的高度接触、传染性的恶性淋巴肿瘤性疾病。MDV是世界上第1个能用疫苗免疫预防的肿瘤疾病。正常细胞和癌细胞表达的β2m蛋白以及在临床上的应用已成为近年来人们研究的热点。本实验室在前期蛋白质组学研究中发现,在MDV感染鸡皮肤和法氏囊中鸡p2-微球蛋白（chicken β2-microglobulin, chβ2m）异常表达的现象。然而chβ2m研究相对较少,并且对chβ2m在肿瘤与致病中的作用目前没有报道,因此,对chβ2m在MDV感染过程中作用研究,不仅可为全面了解MDV的致病机制,有效控制MD发挥重要作用,重要的是可为人类癌症新的治疗靶位发现提供借鉴,有十分重要的理论意义。1.鸡β2-微球蛋白的克隆与原核表达本研究通过RT-PCR从正常免疫鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360bp,编码120个氨基酸,与已登录的chβ2m序列（GenBank:M84767.1, AY989898, Z48921）相一致,同源性为100%；然后将其克隆入pET-32a（+）,经0.8mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清；利用His标签纯化该蛋白,SDS-PAGE分析仅见约34kDa大小的chp2m融合蛋白条带；western blot分析表明,纯化后的chp2m融合蛋白可与抗His单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）发生反应。以上结果证实,本研究成功克隆chp2m基因并获得原核表达载体pET-32a-chβ2m,利用该表达系统能够纯化得到大量可溶性chβ2m融合蛋白,可为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。2.鸡β2-微球蛋白优势多肽序列的选择与单克隆抗体的制备本研究对chβ2m与人、小鼠等其他种类β2m序列比较及抗原性分析后,选取chβ2m羧基端29个氨基酸序列合成多肽（NH2-TPSSGSTYACKVEHETLKE PQVYKWDPEF-COOH）免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选抗chp2m mAb并对其特性进行鉴定。结果筛选出五株抗chp2m mAb, IgG亚类鉴定1E2,2E9,7D5为IgM型,3D1与6E7属于IgG1/κ型；Western blot和间接免疫荧光分析发现,抗体6E7与3D1同人和小鼠β2m无交叉反应性,仅能识别转染pcDNA3.1-chβ2m的293T细胞和HD11细胞中的chp2m抗原；血清Western blot显示,抗体3D1可识别鸡血清和血浆中的chp2m,而与牛和鸭血清无任何反应；流式细胞术表明3D1可以与MSB1细胞中天然的chp2m反应；另外,通过免疫组化分析发现,在胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官均能表达chp2m,但不同区域细胞的表达水平具有差异性。以上结果均证实,本研究成功筛选出抗chp2m单克隆抗体,其具有良好的特异性,适用于多种免疫化学技术,可为进一步探索β2m在免疫学与致病过程中的功能研究提供有力的工具。3.稳定表达鸡p2-微球蛋白293T细胞的筛选与鉴定本研究将重组真核表达质粒pcDNA3.1-chβ2m通过脂质体转染人胚肾上皮细胞系293T后,利用zeocin筛选能稳定表达chp2m的细胞系293T-chβ2m,并对其表达情况进行鉴定。结果显示,质粒转染72h后,加入药物zeocin （500μg/ml）筛选4周后获得药物抗性细胞；Western-blot鉴定发现chβ2m不仅可在抗性细胞中高效表达,其上清中也可检测到分泌的chβ2m;间接免疫荧光表明,抗chβ2m抗体能够检测到抗性细胞内chβ2m呈强荧光反应；应用免疫共沉淀方法筛选能够与chβ2m在293T细胞中结合的免疫相关蛋白,未发现chβ2m与人MHC-Ⅰ结合的现象。以上结果证实,本研究成功筛选出能稳定表达chβ2m的细胞系293T-chβ2m,不仅可为获取真核表达的chβ2m提供材料,也可为β2m可能的相互作用蛋白研究提供借鉴。4.鸡β2-微球蛋白及其MHC-Ⅰ在马立克氏病毒感染不同细胞中的基因表达本研究以MDV meq作为MDV感染标示分子,应用荧光定量PCR技术对chβ2m、MHC-I和Meq在MDV感染不同细胞中基因表达水平进行检测。结果显示,在BUdR刺激下,MDV淋巴癌细胞系MSB1中Meq基因表达水平随着培养时间不断上调（48h, P<0.01）,chp2m基因表达水平于培养后24h上调显著（P<0.01）,48h虽然上调,但上调不显著（P>0.05）,而MHC-Ⅰ随着培养时间显著下调,特别是48h后MHC-Ⅰ下调显著（P<0.01）；通过GA株感染CEF后发现,Meq基因表达水平在MDV感染的CEF细胞中逐渐上调,于感染后120h （hours post-infection）达到最高峰,MHC-Ⅰ在MDV感染CEF前期24hpi较对照组明显升高（P<0.05）,在120hpi显著低于对照组（P<0.05）,而chβ2m在前期显著上调,于24hpi和120hpi（P<0.01）上调显著;另外,我们调查了MDV RB1B株感染鸡外周血淋巴细胞内表达情况,发现Meq基因表达水平于感染后第7天（dpi）开始表达,28dpi达到高峰,chp2m与MHC-I在感染前期显著上调（4dpi, P<0.01）,只有在MDV感染潜伏期（14dpi,28dpi）, MHC-I与chp2m同对照组相比明显下调（P<0.01）,感兴趣的是于35dpi后chp2m与MHC-I又恢复上调趋势。研究结果表明,chβ2m与IHC-I在MDV感染不同细胞中呈波动式变化,与MHC-I相比,chβ2m在感染前期出现异常表达上调,这提示chp2m在MDV感染过程中具有潜在的功能。另外,我们发现chβ2m与MHC-I表达不一致的现象,其机理有待于进一步研究。5.抗鸡β2-微球蛋白单克隆抗体对MSB1细胞的作用及机制本研究在正常培养的MSB1细胞中加入不同浓度chp2m抗体后利用CCK-8法检测细胞生长活力,然后通过Annexin V/PI流式细胞术、DNA ladder和DAPI核染色观察chp2m抗体对MSB1细胞的凋亡情况,并利用Real-time PCR检测凋亡相关信号分子caspase-3.8.9的表达。结果显示,加入20.40.60.80μg/mL chβ2m抗体后,60μg/mL （P<0.05）和80μg/mL （P<0.01） chβ2m抗体共培养的MSB1细胞生长活力显著低于同浓度IgG对照组和正常培养细胞空白组,且随着培养时间的增加chp2m抗体（80μg/mL）对MSB1细胞生长抑制活力显著增加；流式细胞术分析发现,于48h后chβ2m抗体（80μg/mL）可明显引起MSB1细胞的凋亡,AnnexinV+阳性细胞可达51.7%; DNA ladder和DAPI核染色观察发现,chβ2m抗体（80μg/mL）与MSB1细胞作用48h后,可见典型的凋亡中后期细胞基因组断裂形成的梯带和DAPI核染出现的核浓缩、不规则等明显的凋亡特征；Real-time PCR检测caspase-3.8.9等信号分子表达显示,在加入chβ2m抗体后caspase-9和caspase-3较IgG对照组表达明显上调（P<0.01）,而caspase-8在基因水平上无明显的差异。以上结果表明,利用抗体阻断chp2m后可通过caspase-9和caspase-3的高表达引起MDV肿瘤细胞MSB1的凋亡。6.鸡胚成纤维细胞过表达鸡β2-微球蛋白对MDV感染复制的影响在前期研究中发现,chβ2m在MDV感染不同体内外细胞中异常表达的现象。为初步探索鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts, CEF）过表达chp2m对MDV感染复制的影响。本研究通过MDV感染CEF细胞后利用脂质体转染的方法将不同浓度pcDNA3.1-chp2m（4μg,0.4μg）与pcDNA3.1对照质粒（4μg）分别转染CEF细胞,于转染后不同时间点应用Real-time PCR检测不同转染组细胞内gB、meq以及chβ2m的基因表达水平。结果显示,在转染4μgpcDNA3.1-chβ2m的CEF感染组中,chp2m随着培养时间的延长表达水平不断升高,于培养后72h较pcDNA3.1-chβ2m0.4μg转染组和pcDNA3.1空载体转染组上调极显著（P<0.01）；随着chβ2m在细胞内表达的提高,MDV gB与meq基因表达水平较低浓度转染组（0.4μg）和空质粒转染对照组都明显提高（72h, gB P<0.01; Meq, P<0.05）,而chβ2m、gB与meq mRNA水平在低浓度转染组与转染对照组之间无显著差异。以上结果表明,MDV在体外过表达chβ2m CEF细胞中其感染复制能力相应上调,可为chβ2m在MDV-宿主相互作用关系中的作用研究提供理论价值。