论文摘要
前言宫颈癌（cervical cancer，CC）是妇女最常见的恶性肿瘤之一，现已确认高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）是宫颈癌形成最重要的危险因子，99.7％的浸润性宫颈癌中可以检测到HR-HPV的存在。因此，通过高危HPV的检测来筛查易患人群，追踪HPV感染状态，随访HPV是否被清除，是预防宫颈癌发生的关键。但并非所有感染HPV的患者都会发展为宫颈癌，仅检测到患者感染了HPV而不进一步检查就无法了解宫颈病变的程度和发展趋势。人宫颈癌基因（cervical cancer oncogene，HCCR，包括HCCR-1和HCCR-2两种）在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈癌中呈高表达，在正常对照组不表达，因此如果通过对宫颈癌病因学因素HPV和生物标志物因素HCCR的联合检测，来对宫颈癌高危人群进行筛查，可能具有重要意义。本研究对41例宫颈液基细胞残液及相应的组织学标本应用原位杂交法检测HPV16／18，并用免疫组化法检测HCCR，以探讨二者在子宫颈癌发生发展中的生物学意义及临床应用价值，试图为提高宫颈癌易患人群检出率，进而为宫颈癌的预警和早期诊断提供更科学有效的方法，达到早诊早治，降低宫颈癌发病率死亡率的目的；并为开发简便易得的分子筛查技术资源提供理论基础。材料和方法1、材料（1）研究对象570例宫颈液基细胞学残液标本，均经LCT（Liquid-based Cytology Test，LCT系统）诊为宫颈上皮内瘤变及宫颈癌，来自2005年11月～2006年11月中国医科大学附属第一医院妇科。年龄19～76岁，平均48.53岁。无宫颈手术史、未孕、无盆腔放射治疗史。本研究组取其中经活检或切除后具有相应组织学标本者31例，并随机选取6例炎症和4例正常标本作为对照，年龄25～68岁，平均年龄46.7岁。其中宫颈癌组6例、CINⅡ／Ⅲ组14例、CINⅠ组11例、炎症组6例（包括形态学诊为HPV感染和炎症的病例）、正常对照组4例。细胞学分组以相应组织学诊断为分组依据。（2）主要试剂、仪器和来源HPV原位杂交试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。HCCR蛋白兔抗人多克隆抗体出韩国Jin Woo Kim教授惠赠（本抗体是针对HCCR-1和HCCR-2相同C-末端氨基酸序列的多克隆抗体，具有较好的特异性）。DAB显色试剂盒和免疫组化S-P试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。2、方法（1）免疫组织化学染色：用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测HCCR的表达。结果判定：HCCR蛋白定位于胞浆，胞浆内见棕黄色颗粒为阳性。由3名有经验的病理医师在双盲法下独立计数。细胞涂片主要计数有病变的细咆，异常宫颈上皮细胞着色大于10％则判定为阳性标本。细胞片和组织片在光镜下根据着色范围分为：阳性细胞数小于10～24％为（+）；阳性细胞数25～49％：勾（++）；阳性细胞数50～74％为（+++）；阳性细胞数大于75％为（++++）。（2）原位杂交：检测HPV16／18 DNA的表达。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞数小于25％为（+）；阳性细胞数25％～49％为（++）；阳性细胞数50％～74％为（+++）；阳性细胞数75％～100％为（++++）。（3）统计学分析：对所得结果各组间采用x2检验及Fisher’s确切概率法检验，P＜0.05有统计学意义；用Spearman等级相关分析检验HPV16／18感染与HCCR表达的关系，P＜0.05有统计学意义。结果1、免疫组化法检测HCCR的表达HCCR在细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。HCCR在正常宫颈脱落细胞及宫颈组织中不表达，在各组宫颈病变中有不同程度的表达：在炎症、CINⅠ、Ⅱ／Ⅲ和宫颈癌中，HCCR的阳性率分别为16.7％（1／6）、72.7％（8／11）、78.6％（11／14）和100％（6／6），随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势，在宫颈脱落细胞中和相应宫颈组织中检测结果基本一致。2、原位杂交法检测HPV16／18 DNA的表达。HPV16／118 DNA在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，部分病例可在胞浆中见到棕黄色颗粒。HPV16／18 DNA在正常宫颈脱落细胞及宫颈组织中不表达，在各组宫颈病变中有不同程度的表达：在炎症、CINⅠ、Ⅱ／Ⅲ和宫颈癌中，HPV16／18 DNA的阳性率分别为50％（3／3）、54.5％（6／11）、71.4％（10／14）和83.3％（5／6），随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势，在宫颈脱落细胞和相应宫颈组织中检测结果基本一致。3、HCCR的表达与HPV16／18感染在宫颈病变中的相关性HCCR的表达与HPV16／18感染在CIN及宫颈癌中呈正相关（rs=1，P＜0.005）。讨论子宫颈癌是危及妇女生命的主要疾病，其发生、发展是一个由量变到质变、渐变到突变的过程。近代临床和分子生物学的研究证实：高危HPV尤其是HPV16、18型是子宫颈癌肯定的发病原因，因此认为进行HPV感染和宫颈癌的筛查十分必要。人宫颈癌基因HCCR是于2003年发现的新的癌基因。在正常宫颈上皮及癌旁组织中不表达，而在宫颈癌组织中呈现高表达，因此HCCR可能成为宫颈癌的生物标志物。HCCR蛋白可以与P53蛋白结合而增加其稳定性，但却同时抑制了P53的功能，因此它作为P53的负调节因子而引起细胞的永生化和肿瘤的形成。并非所有感染HPV的患者都会发展为宫颈癌，仅检测到患者感染了HPV而不进一步检查就无法了解患者宫颈病变的程度和发展趋势。单纯依靠检测HPV来筛查宫颈癌不仅不够准确，而且会引起患者的恐慌。因此如果通过对宫颈癌病因学因素HPV和生物标志物因素HCCR的联合检测，来对宫颈癌高危人群进行筛查，可能具有重要意义。尤其是在宫颈液基细胞学残液标本中对二者进行检测，使一份标本两用，简化了取样程序，降低了费用，这种无创性筛查必然是医生和患者都乐于接受的。本研究中我们检测了HCCR和HPV16／18的表达情况，发现二者在CIN及宫颈癌中，随着病变的程度的加重而阳性率升高。在炎症组（包括诊断为HPV感染的病例），HPV16／18的阳性率较高（50％），而HCCR的阳性率则较低（16.7％），可见对HPV16／18阳性的病例检测HCCR能够早期发现宫颈癌和癌前病变及预知宫颈病变的程度，有利于提高宫颈CIN及宫颈癌筛查的准确度，缩小可疑宫颈癌的范围，以便为临床的治疗和处理工作提供较为可靠的参考信息。本研究同时检测了宫颈液基细胞残液和相应组织中HCCR和HPV16／18的表达情况，旨在探讨能否利用宫颈液基细胞残液来对宫颈癌及癌前病变进行筛查。结果发现在宫颈液基细胞残液和相应组织中，HPV和HCCR的表达情况基本一致。可见，通过检测宫颈液基细胞残液中HPV16／18和HCCR的表达来对宫颈癌及癌前病变进行筛查，具有很大的可行性。结论1、HCCR和HPV16／18在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中，随着病变程度的加重而检出率增高。2、HCCR的表达和HPV16／18的感染在宫颈病变中呈正相关，二者联合检测可提高宫颈病变筛查的准确度。3、无论是HCCR还是HPV16／18，在宫颈液基细胞学残液和相应组织中的检测结果都是基本一致的，利用宫颈液基细胞学残液对宫颈癌进行筛查具有很大的可行性。
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