不同金属离子诱导枸杞体细胞胚发生及枸杞多倍体培育研究

论文摘要

植物体细胞胚发生的机理研究和多倍体诱导的技术优化一直是植物分子及细胞生物学中的两个热点问题。已有的研究表明,不同价位金属离子分别对宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）体细胞胚发生的调节效应和作用机制差异显著,但在同一条件下的比较试验严重不足,且以体细胞胚为基底的同源四倍体诱导非常少见。本研究以宁夏枸杞代表品种—宁红1号为试验材料,以不同价位的金属离子Ag+、Ca2+和Eu3+的可溶性化合物按照不同浓度梯度作为外源影响因子,试验研究了三种不同外植体根基部、茎和叶切块体细胞胚发生的效率和相对生长速率;同时试验比较了体细胞胚、愈伤组织和激活种子在不同浓度梯度的秋水仙素和DMSO混合液诱导下枸杞同源四倍体发生效率,并对育成的同源四倍体进行了细胞学和形态学分析。以上两个方面为今后枸杞体细胞胚诱导的高效体系的建立和植物同源多倍体技术优化提供理论基础,为将来名贵中药材高效同质多倍体的培育、减少或避免嵌合体干扰的产生、提高诱变效率提供实践途径。主要试验结果如下:1.枸杞无菌苗长至3-4片真叶后,将根基部、茎和叶切成小块,在MS+2,4-D0.2mg/L的诱导培养基上进行愈伤组织诱导,发现真叶被诱导得到的胚性愈伤组织长势最好、相对生长速率最高,转入无激素MS培养基时得到的体细胞胚数最多。叶愈伤组织比起根基部和茎被诱导得到的愈伤组织质地紧密,相对生长速率达到0.04g/（d·外植体）、而根基部和茎的都是0.02g/（d·外植体）;转入无激素MS培养基15天时,每块胚性愈伤组织所诱导的体细胞胚数分别是根39.1个、茎42.8个、叶44.9个。2.根基部、茎和叶为外植体诱导得到的愈伤组织在含2,4-D 0.2mg/L的MS培养基上4次继代培养后,转入含不同浓度梯度的Ag+、Ca2+和Eu3+三种外源离子的MS培养基进行分化培养,发现三种离子在低浓度情况下均可促进愈伤组织的体细胞胚发生,而高浓度抑制体细胞胚的形成,且体细胞胚数在三种外植体中具有相同的变化趋势。当Ag+浓度为1mg/L时,每块叶愈伤组织形成的体细胞胚数为对照组的2倍多,Ca2+和Eu3+在其较适宜浓度下均无达到这个水平。3.枸杞多倍体诱导:愈伤组织:枸杞无菌苗叶片在MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA激素条件下诱导出来的无绿色芽点、质地紧密的愈伤组织为试验材料,在0.2%秋水仙素和2%DMSO混合液处理48h时诱导率高达66.7%,且嵌合体少、同质性高,是较好的枸杞多倍体诱导的方法。激活种子:将枸杞种子经常规消毒后浸于无菌水中,待种子露白时用0.2%秋水仙素和2%DMSO混合液浸泡24h时诱导率最高达8%,但嵌合体现象严重,多倍体的特征不稳定,表现出不同程度的回复突变。体细胞胚:枸杞无菌苗叶片在含0.2mg/L2,4-D的MS培养基上诱导出来的愈伤组织在相同培养基上继代培养4次后,转入不含激素的MS培养基上分化10天所得到的球形胚为试验材料,在20mg/L秋水仙素和1%DMSO混合液处理24h时诱变率6%、无嵌合体现象。本文首次报道,在体细胞胚的离体条件下,通过秋水仙素处理诱导获得了枸杞同源四倍体。4.染色体计数鉴定表明,正常二倍体植株染色体数为24,所得到的四倍体植株染色体增加一倍,为48条染色体。5.从形态学和细胞学方面对四倍体植株和二倍体植株进行了比较。结果显示,形态上四倍体比二倍体植株根系较少,但粗壮。四倍体植株与二倍体植株在气孔大小、频度具极显著差异。在40倍镜下,四倍体气孔长度31.9μm,二倍体植株气孔长度24.3μm;四倍体宽度29.0μm,二倍体宽度23.9μm。而在10倍镜视野内,气孔频度四倍体的21.6个,二倍体的是27个。四倍体气孔叶绿体数分布范围在24—50个,其中叶绿体数为38的占17%左右;二倍体气孔包围细胞叶绿体数分布范围在12—28个,其中叶绿体数为20的占25%。四倍体和二倍体气孔叶绿体数之比约等于2。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 体细胞胚研究进展
• 1.1 胚胎发生的普遍性
• 1.2 胚状体的发生途径和特征
• 1.2.1 直接途径
• 1.2.2 间接途径
• 1.3 体细胞胚发生过程中的生理生化变化
• 1.4 体细胞胚发生的几个关键影响因素
• 1.4.1 内源激素水平对体细胞胚发生的影响
• 1.4.2 外源生长调节剂对体细胞胚发生的诱导作用
• 1.4.3 基因型与外植体类型对体细胞胚发生的影响
• 1.4.4 金属离子对体细胞胚发生的影响
• 1.5 体细胞胚胎发生相关基因和相关蛋白质研究
• 2 药用植物多倍体诱导研究概述
• 2.1 植物染色体工程
• 2.2 多倍体的概念、种类与由来
• 2.3 药用植物离体多倍体诱导
• 2.3.1 多倍体在中药材生产上的应用优势
• 2.3.2 人工诱导多倍体的方法
• 2.3.3 多倍体植株鉴定
• 3 枸杞组织培养研究进展
• 3.1 多倍体植株的培育
• 3.1.1 四倍体培育
• 3.1.2 三倍体培育
• 3.2 胚培养
• 3.3 胚乳培养
• 3.4 原生质体培养及遗传转化再生植株
• 4 本研究目的和意义
• 第二章 不同金属离子对枸杞体细胞胚发生的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 植物试验材料
• 1.2 无菌苗的获得
• 1.3 组织培养
• 1.3.1 外植体的选择
• 1.3.2 愈伤组织的诱导
• 1.3.3 愈伤组织相对生长速率
• 1.4 体细胞胚诱导
• +、Ca²⁺、Eu³⁺ 三种离子对体细胞胚的影响'>1.5 Ag⁺、Ca²⁺、Eu³⁺三种离子对体细胞胚的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体的选择
• 2.2 三种离子对体细胞胚的作用
• 3 讨论
• 第三章 枸杞多倍体诱导
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 利用体细胞胚诱导四倍体
• 1.2.1 体细胞胚的诱导
• 1.2.2 体细胞胚的挑选
• 1.2.3 四倍体诱导
• 1.2.4 体细胞胚的生根诱导
• 1.3 利用愈伤组织诱导多倍体
• 1.3.1 愈伤组织的诱导
• 1.3.2 秋水仙素处理方法及培养条件
• 1.4 利用种子诱导多倍体
• 1.4.1 种子的预处理
• 1.4.2 秋水仙素处理
• 1.4.3 生根培养
• 1.5 倍性鉴定
• 1.5.1 形态鉴定法
• 1.5.2 细胞学鉴定法
• 1.5.3 染色体计数法
• 2 结果与分析
• 2.1 利用体细胞胚诱导枸杞四倍体
• 2.2 利用愈伤组织诱导四倍体
• 2.3 利用激活种子诱导四倍体
• 2.4 植株的倍性鉴定
• 2.4.1 形态学鉴定
• 2.4.2 细胞学鉴定
• 3 讨论
• 第四章 结论与建议
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢