论文摘要
论文首先从液体培养体系出发,探索不同培养条件对白毒鹅膏菌分泌漆酶的影响。我们筛选出白毒鹅膏菌的综合产酶培养基为（g/L）:马铃薯200 g/L、麸皮20 g/L、KH2PO43g/L、MgSO41.5g/L、VB10.01 g/L、酵母膏5 g/L。其最佳pH值范围为5.0-5.4,转速为120 rpm,温度为25℃,装液量为50 mL。按此条件进行培养,漆酶从第5d酶活力迅速提升,第8d达产酶高峰,随后产酶能力下降。实验通过盐析、透析、DEAE-纤维素DE52离子交换层析和Sephedex G-100凝胶过滤层析等步骤,分离纯化得到电泳纯的漆酶。以邻联甲苯胺作为底物,最终漆酶被纯化了22.03倍,活力回收率为22.02%。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,漆酶的相对分子量为63kDa。该酶具有较宽的pH值稳定性,在pH 3.6到5.2范围内能够较好地保持酶活力;该漆酶最适反应温度为20℃,在20℃到60℃范围内能够稳定的保持较长时间,但在70℃时保持5 min,且能保持20%的活力。β-巯基乙醇或L-半胱氨酸是该酶的高效抑制剂,但是EDTA或DMSO对其抑制作用不是很强。白毒鹅膏菌漆酶催化反应符合Miehaelis-Menten动力学规律。在20℃,pH 4.6的醋酸缓冲溶液中,漆酶以邻联甲苯胺作为底物时,米氏常数为66.7μmol/L。潜在的抑制剂测试中,L-半胱氨酸及2-巯基乙醇在所试浓度范围内均完全抑制漆酶的活力,SDS高浓度时对漆酶的活力高度抑制,EDTA和DMSO在所试浓度范围内对漆酶的活力微弱抑制。利用白毒鹅膏菌漆酶可以较为彻底的降解6种染料,底物范围较广,在降解过程中,要持续通氧气（振荡）。直接黑G降解的最适pH值为5.2,而中性深黄GL降解的最适pH值为3.5。两种染料与白毒鹅膏菌漆酶作用的最适温度均为50℃。底物染料浓度为20mg/mL时,酶活力超过10 U/mL后,进一步提高酶活力对rD基本无影响,中性深黄GL总脱色率维持在80%左右,直接黑G约维持在60%。采用海藻酸钠包埋法和海藻酸钠-壳聚糖包埋-交联法固定化漆酶。探讨了固定化条件、固定化漆酶及游离酶的酶学性质。结果表明,包埋法和包埋-交联法固定化漆酶的最佳条件分别为海藻酸钠浓度3%、CaCl2浓度1.5%和海藻酸钠浓度2%、CaCl2浓度2%、壳聚糖浓度1.5%、戊二醛浓度1%。两种固定化漆酶的最适pH和最适温度相同,分别为5.0和30℃,游离酶为4.6和20℃。将固定化酶应用在偶氮染料的脱色中,包埋法脱色效果接近游离酶并且在重复进行的摇床实验中,脱色能力未降低,反应前后的酶活力均没有损失。与包埋法相比,包埋-交联法固定化漆酶机械强度更强,操作稳定性更好,使得固定化酶的重复利用率更高,但应用于染料脱色时,由于壳聚糖的吸附作用使得漆酶对于染料的降解作用降低,因此制备应用于染料降解的固定化漆酶时还应对辅料进行优化。