两种氨基酸添加下酪蛋白类蛋白物的抗氧化活性研究

论文摘要

酪蛋白是优质的蛋白质,具有溶解、乳化、起泡、胶凝以及生物活性如抗菌活性、抗氧化活性、降血压活性等功能性质,可以广泛地应用于各类食品中。类蛋白反应是通过蛋白酶的催化作用进行的一种反应,通过类蛋白反应合成的类似蛋白质的物质,可提高蛋白质的营养功能和加工特性,提高蛋白产品的附加值。本研究通过木瓜蛋白酶水解酪蛋白制备出酪蛋白水解物。添加苯丙氨酸或酪氨酸并利用木瓜蛋白酶对水解物进行类蛋白反应修饰。选择具有最高抗氧化活性的修饰产物进行分级处理,并用水解物作为对照。用3：7、4：6、5：5、6：4（v/v）四种乙醇水溶剂（E-W）或甲醇水溶剂（M-W）对其进行分级处理,对水解物、修饰产物以及分级产物的抗氧化活性进行分析评价。本研究的具体结果如下：1)利用木瓜蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解物,通过水解度、蛋白回收率、DPPH清除率等方面评价,选择反应时间为2h的水解产物为类蛋白反应的底物,此水解物的水解度为9.4%、DPPH清除率为38.7%。2)在木瓜蛋白酶催化的类蛋白反应中添加苯丙氨酸或酪氨酸。反应时间固定为5h,通过响应面分析法优化得到类蛋白反应的适宜条件为：反应温度30℃、底物浓度50%（w/v）、酶添加量3kU/g蛋白质、氨基酸添加量0.74mol/mol。3)此优化条件下制备出的修饰产物,以水解物或水解物和苯丙氨酸或酪氨酸的混合物为对照,评价它们的抗氧化活性。结果显示不添加苯丙氨酸或酪氨酸的类蛋白反应可以改善酪蛋白水解物的三种抗氧化性质,而添加苯丙氨酸或酪氨酸的修饰产物能够进一步提高酪蛋白水解物的DPPH清除能力（从38.7%提高至45.6-49.3%）、还原能力（从0.497提高至0.608-0.662）、·OH清除率（从17.2%提高至21.2-29.7%）。并且在添加苯丙氨酸或酪氨酸的修饰产物的抗氧化性质与反应时间、苯丙氨酸或酪氨酸添加量之间的关系不明显。4)分级处理可以进一步提高酪蛋白水解物的类蛋白修饰产物的抗氧化性质。分级产物的上清部分（或沉淀部分）具有更高的（或更低的）抗氧化活性。随着乙醇溶剂或甲醇溶剂的浓度增加,分级产物上清部分的抗氧化活性逐渐增强,沉淀部分则相反。本研究中,修饰产物4的上清部分和沉淀部分对DPPH的清除能力的IC50分别为0.69mg/mL和2.09mg/mL,差异最显著,说明分级处理可有效的提取出抗氧化活性更高的物质。5)从氨基酸组成分析中我们可以看出：与沉淀部分相比,分级产物中上清部分含有更多的疏水性氨基酸,也就是抗氧化活性较高的分级产物中含有的疏水性氨基酸也较高。但抗氧化肽的氨基酸组成与其抗氧化活性的具体关系尚不明显,有关机理仍需要进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 酪蛋白概述
• 1.1.1 酪蛋白的性质
• 1.1.2 酪蛋白及其产品在食品工业中的应用
• 1.2 蛋白质水解的国内外现状
• 1.2.1 蛋白质水解物的功能性质
• 1.2.2 生物活性
• 1.3 自由基与自由基清除
• 1.3.1 生物体外的自由基
• 1.3.2 生物体内的自由基
• 1.3.3 自由基与衰老和疾病的关系
• 1.3.4 自由基的清除
• 1.4 抗氧化肽
• 1.4.1 抗氧化肽的研究现状
• 1.4.2 体外抗氧化活性评价方法
• 1.4.3 抗氧化肽的构效关系
• 1.4.4 抗氧化肽的应用
• 1.5 类蛋白反应
• 1.5.1 类蛋白反应机理
• 1.5.2 影响因素
• 1.5.3 应用
• 1.6 研究目的与意义
• 1.7 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 原料与试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 酪蛋白水解物的制备
• 2.2.3 类蛋白反应条件优化
• 2.2.4 有关分析
• 2.2.5 酪蛋白水解物与修饰产物的分级处理
• 2.2.6 氨基酸组成分析
• 2.2.7 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 酪蛋白水解物的制备
• 3.1.1 蛋白酶活力的测定
• 3.1.2 游离氨基测定
• 3.1.3 酪蛋白水解物制备条件的优化
• 3.2 抗氧化肽的类蛋白反应修饰
• 3.2.1 添加苯丙氨酸对类蛋白反应的影响
• 3.2.2 添加酪氨酸对类蛋白反应的影响
• 3.2.3 修饰产物的抗氧化活性评价
• 3.3 分级产物的抗氧化活性
• 3.4 修饰产物的氨基酸组成
• 4 讨论
• 4.1 酪蛋白水解条件的选择
• 4.2 类蛋白修饰产物的抗氧化活性
• 4.3 分级产物的抗氧化活性与氨基酸组成
• 5 结论
• 6 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文