H5N1亚型禽流感病毒NS1149位氨基酸对生物学功能的影响

论文摘要

以有限稀释法纯化早期病毒分离储存液,得到两株对鸡致病性完全不同的H5N1亚型毒株。其中A/Goose/Guangdong/1/96（GSGD/1/96）为中国大陆首次分离到的H5N1亚型高致病力禽流感病毒,A/Goose/Guangdong/2/96（GSGD/2/96）为H5N1亚型低致病力禽流感病毒。全基因组测序表明:二者HA裂解位点氨基酸相同,而各基因编码的氨基酸中却存在五个氨基酸差异。本论文即为研究H5N1亚型禽流感病毒GSGD/1/96和GSGD/2/96对鸡完全不同致病性的决定因素。利用反向遗传基因操作技术,将其两株病毒的基因组分别克隆到PBD载体上构建成转染质粒,两株病毒存在有不同氨基酸的转染质粒分别替换重组,转染293T细胞,拯救重组病毒。成功救获出重组病毒有RGD/1/96、RGD/1/2PA、RGD/1/2NP、RGD/1/2M、RGD/1/2NS、RGD/2/96、RGD/2/1PA、RGD/2/1NP、RGD/2/1M、RGD/2/1NS。10株重组病毒和两个亲本野毒对SPF鸡的致病性实验表明, GSGD/1/96、GSGD/2/96 H5N1亚型的禽流感病毒的NS基因在对鸡的致病性方面起重要的作用。两株亲本野毒和四株重组病毒RGD/1/96、RGD/2/96、RGD/1/2NS、RGD/2/1NS鼻腔感染6周龄的SPF鸡和4周龄的非免疫鹅。实验结果显示H5N1亚型的禽流感病毒GSGD/1/96、GSGD/2/96对SPF鸡和非免疫鹅表现出不同的感染程度,进一步说明了NS基因编码的NS1非结构蛋白对流感病毒在鸡鹅体内的增殖起重要的作用,并且这两株病毒NS1非结构蛋白只有149位氨基酸不同,也可以说NS1 149位氨基酸在H5N1亚型禽流感病毒GSGD/1/96、GSGD/2/96致病性方面起决定性的作用。两株H5N1亚型禽流病毒对SPF鸡的致病性差异主要源于NS1非结构蛋白149位氨基酸的不同。为进一步阐明GSGD/1/96、GSGD/2/96 NS1 149位氨基酸对NS1蛋白拮抗干扰素的影响。将利用反向基因操作技术救获的四株病毒RGSGD/1/96、RGSGD/2/96、RGD/1/2NS、RGD/2/1NS感染鸡胚成纤维细胞诱生干扰素,然后用插入荧光蛋白的水泡性口炎病毒（VSV-GFP）检测干扰素的含量。结果表明149位氨基酸影响NS1蛋白拮抗干扰素功能,在病毒感染过程中, NS1蛋白149位为Val时拮抗干扰素系统的能力弱,病毒感染鸡胚成纤维细胞诱导产生的干扰素足以抑制VSV-GFP的增殖。NS1蛋白的149位为Aal时拮抗干扰素系统的能力强,病毒感染不能诱导产生足量的干扰素来抑制VSV-GFP的增殖。

论文目录

• 1 引言
• 1.1 禽流感的概述
• 1.1.1 禽流感病原及其特性
• 1.1.2 禽流感流行的历史和现状
• 1.2 禽流感病毒的生物学特性
• 1.2.1 禽流感病毒的复制
• 1.2.2 禽流感病毒表面蛋白血凝素的结构和功能
• 1.2.3 禽流感病毒神经氨酸酶的结构和功能
• 1.2.4 禽流感病毒内部基因的结构功能
• 1.2.5 非结构蛋白结构和功能
• 1.3 A 型流感病毒反向遗传技术
• 1.3.1 流感病毒反向遗传技术的发展历史
• 1.3.2 流感病毒反向遗传技术的应用
• 1.4 流感病毒与宿主的免疫反应
• 1.5 干扰素及其研究进展
• 1.5.1 干扰素的发现与分类
• 1.5.2 干扰素的产生和分布
• 1.5.3 干扰素的主要生物学功能
• 1.5.4 干扰素作用机理
• 1.5.5 干扰素及其基因组结构
• 1.5.6 流感病毒 NS1 蛋白对干扰素诱生的影响
• 1.6 本研究目的和意义
• 2 实验部分
• 2.1 H5N1 亚型禽流感病毒反向基因操作技术的建立
• 2.1.1 材料和方法
• 2.1.1.1 病毒和实验动物
• 2.1.1.2 病毒的序列测定
• 2.1.1.2.1 主要的试剂与仪器
• 2.1.1.2.2 RNA 提取与反转录
• 2.1.1.2.3 PCR与目的片段的回收
• 2.1.1.2.4 目的片段的克隆
• 2.1.1.2.5 序列测定
• 2.1.1.3 反向遗传技术
• 2.1.1.3.1 PBD 载体
• 2.1.1.3.2 主要试剂
• 2.1.1.3.3 引物
• 2.1.1.3.4 病毒RNA提取、反转录与 PCR
• 2.1.1.3.5 重组pBD 质粒的构建
• 2.1.1.3.6 病毒拯救
• 2.1.1.3.7 转染
• 2.1.1.3.8 救获病毒的鉴定
• 2.1.1.4 救获病毒对 SPF 鸡的致病性实验
• 2.1.1.4.1 病毒和实验动物
• 2.1.1.4.2 鸡胚半数感染量（EID50）的测定
• 2.1.1.4.3 对 SPF 鸡的致病性实验
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.2.1 两株病毒的序列比较
• 2.1.2.2 质粒构建
• 2.1.2.3 转染
• 2.1.2.4 救获病毒鸡胚半数感染量（EID50）的测定
• 2.1.2.5 救获病毒对 SPF 鸡致病性结果
• 2.1.3 讨论
• 2.2 H5N1亚型禽流感病毒NS1 149位氨基酸的改变对鸡、鹅致病性的影响
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.1.1 实验用病毒
• 2.2.1.2 实验用动物
• 2.2.1.3 鸡鹅鼻腔感染实验
• 2.2.1.4 感染鸡、鹅组织病毒滴定
• 2.2.2 结果与分析
• 2.2.2.1 SPF 鸡组织病毒滴定结果
• 2.2.2.2 非免疫鹅组织病毒滴定结果
• 2.2.2.3 感染鸡、鹅10 天后发病死亡情况
• 2.2.3 讨论
• 2.3 H5N1 亚型禽流病毒 NS1 149 位氨基酸的改变影响干扰素的诱生
• 2.3.1 材料和方法
• 2.3.1.1 病毒
• 2.3.1.2 实验用细胞
• 2.3.1.3 主要用的试剂与仪器
• 2.3.1.4 细胞半数感染量（TCID）测定
• 2.3.1.5 干扰素的诱生与抗病毒活性的检测
• 2.3.1.6 不同病毒诱生 IFN-α/β的 RT-PCR 鉴定
• 2.3.2 结果与分析
• 2.3.2.1 病毒在鸡胚成纤维细胞的半数感染量测定
• 2.3.2.2 VSV-GFP 在诱生干扰素处理的鸡胚成纤维细胞上的复制
• 2.3.2.3 病毒在鸡胚成纤维细胞诱生干扰素抗 VSV-GFP 活性检测
• 2.3.2.4 病毒在鸡胚成纤维细胞诱生干扰素抗流感病毒 RGD/1/96 活性检测
• 2.3.2.5 病毒在鹅胚成纤维细胞的半数感染量测定
• 2.3.2.6 VSV-GFP 在诱生干扰素处理的鹅胚成纤维细胞上的复制
• 2.3.2.7 病毒在鹅胚成纤维细胞诱生干扰素抗 VSV-GFP 活性检
• 2.3.2.8 病毒在鹅胚成纤维细胞诱生干扰素抗流感病毒 RGD/1/96 活性检测
• 2.3.2.9 不同病毒诱生IFN-α/β的RT-PCR鉴定
• 2.3.3 讨论
• 3 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介