通过RNAi研究水稻磷转运蛋白基因生理功能

论文摘要

作为单子叶模式植物的水稻基因组测序工作已经完成,水稻功能基因组学已成为水稻科研工作的重心。磷酸盐转运蛋白基因在缺磷条件下的强烈表达是水稻适应低磷胁迫的重要机制之一。与磷胁迫相关的磷酸盐转运蛋白基因的生理功能研究,可从分子水平上解释水稻适应低磷胁迫的遗传本质,为水稻对磷营养吸收转运规律的发现、磷肥的科学施用以及水稻产量的维持和提高等提供理论依据。本实验以粳稻日本晴品种为实验材料,通过RNAi分别创造水稻Pht1家族成员中两个缺磷强烈增强表达的基因,OsPT2和OsPT6的沉默突变体,并以沉默效果显著的转基因株系为供试对象进行目标基因的生理功能分析。测定了磷胁迫条件下目标基因的沉默情况,同位素32P示踪吸收情况,Pht1家族大部分基因成员的表达情况,植株干重,植株总磷吸收量,根系形态,种子发芽率等指标,以研究OsPT2和OsPT6基因在水稻磷营养吸收和转运方面的功能。所获得的主要结果如下:以pTCK303为原初载体构建RNAi表达载体的水稻转基因可以导致转基因株系目标基因OsPT2和OsPT6的不完全沉默。不同株系基因沉默程度不一,在缺磷处理条件下,被选作研究材料的两个OsPT2沉默株系r2-1和r2-2,地下部目标基因的沉默程度分别为78.2%和25.7%;地上部目标基因的沉默程度分别41.2%和22.7%。三个OsPT6沉默株系r6-1、r6-2和r6-3,地下部目标基因的沉默程度分别为85.3%、77.5%和45.5%;地上部目标基因的沉默程度分别73.9%、70.1%和71.4%。OsPT2或OsPT6基因的沉默同时影响了同家族其他基因的表达。在缺磷处理条件下,OsPT2的沉默突变体中,以r2-1为例,地下部OsPT1、OsPT6、OsPT8、OsPT12基因的表达均有不同程度的降低,OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT9、OsPT10基因表达均有不同程度的上升;地上部OsPT1、OsPT5、OsPT6、OsPT7、OsPT9基因的表达均有不同程度的降低,OsPT3、OsPT4、OsPT8、OsPT10、OsPT12基因表达均有不同程度的上升。在OsPT6的沉默突变体中,以r6-1为例,地下部OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12基因的表达均有不同程度的降低,OsPT4、OsPT10基因表达有不同程度的上升;地上部OsPT1、OsPT2、OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8、OsPT9、OsPT12基因的表达均有不同程度的降低,只有OsPT10基因表达有微弱的上升。OsPT2或OsPT6基因的沉默都会造成低磷条件下水稻植株干重、植株总吸磷量、总根长、根系总表面积、根系体积、根尖数等指标不同程度的降低。此外,OsPT6基因高效沉默株系r6-1的种子发芽率和种子发芽速率显著低于野生型。综合全文的研究内容可得到以下结论:以pTCK303为原初载体的RNAi表达载体构建,能对目标基因实现有效沉默,显著降低目标基因的表达量,但沉默效果不完全。OsPT2或OsPT6的有效沉默会造成同家族其他磷转运蛋白成员表达量的变化,预示着OsPT2和OsPT6基因与Pht1家族其他成员之间可能存在着功能互作效应。OsPT2或OsPT6的有效沉默会显著降低低磷条件下水稻植株干重和植株总吸磷量,说明OsPT2和OsPT6在低磷条件下维持水稻植株正常生长和磷吸收、转运方面起着十分重要的作用。OsPT2或OsPT6基因的有效沉默会引起低磷胁迫条件下水稻根系总长度、根表面积、根系体积和根尖数等指标的普遍下降,从而造成水稻的根系形态的改变,但这种影响是这两个转运蛋白的直接作用还是通过对水稻体内磷营养状况的改变引起的间接效应有待进一步研究。OsPT6基因的高效沉默会显著降低水稻种子的发芽率和发芽速度,说明OsPT6在水稻种子的磷吸收、同化和转运方面可能起着重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 水稻基因组学研究趋势
• 2 RNAi技术概述
• 2.1 RNAi技术的发现及其原理介绍
• 2.2 RNAi的技术特点
• 2.3 RNAi在植物基因功能研究中的应用
• 2.4 RNAi技术应用的问题与展望
• 3 植物磷转运蛋白基因表达调控和功能研究现状
• 3.1 植物适应土壤磷缺乏的适应机制
• 3.2 植物磷酸盐转运蛋白的研究现状
• 3.3 水稻磷转运蛋白研究现状
• 第二部分 研究思路与材料方法
• 1 研究思路
• 1.1 实验流程设计
• 1.2 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 载体构建
• 2.2 农杆菌介导转基因
• 2.3 基因生理功能分析
• 第三部分 结果与分析
• 1 沉默效果检测与沉默株系选择
• 2 基因表达情况与同位素示踪结果
• 2.1 目标基因RT-PCR与同位素示踪结果
• 2.2 Pht1家族基因的表达情况分析
• 3 植株干重及植株总吸磷量分析
• 3.1 植株干重
• 3.2 植株总吸磷量
• 4 根系形态分析
• 4.1 根系总长度
• 4.2 根系表面积
• 4.3 根系体积
• 4.4 根尖数
• 5 种子发芽情况分析
• 第四部分 讨论
• 1 目标基因的RNAi效果
• 2 Pht1家族其他基因成员表达变化
• 3 沉默突变体表型分析以及OsPT2和OsPT6的生理功能
• 第五部分 全文结论
• 参考文献
• 在读硕士期间发表的论文
• 致谢