1.应用抑制性消减杂交技术（SSH）筛选、分离、克隆急性白血病复发相关基因 2.聚合酶链转化—阻断PCR消减法：一种新的筛选差异表达基因方法的建立和验证

论文摘要

目的1.白血病发生耐药或复发是目前困扰临床、影响白血病治疗效果的最大障碍。迄今尚未分离出与白血病复发相关的基因,而且已知的耐药机制并不能完全解释所有白血病病人发生耐药的机制。抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）是新型的表型克隆研究方法。本研究的目的就是应用抑制性消减杂交法（SSH）构建一对来自同一个体复发与初治时的急性淋巴细胞白血病差异表达基因的cDNA文库,筛选克隆急性白血病复发相关基因。2.目前筛选差异表达基因的主要方法有基因芯片技术、基因表达的系统分析、差异显示PCR方法及抑制性消减杂交法等。以上各种方法均有其优势所在,但也仍存在不足之处,因此,继续探索新的筛选差异表达基因的方法仍有实用价值。本研究拟建立一种新的筛选差异表达基因的方法。方法1.应用抑制性消减杂交法（SSH）构建一对来自同一个体复发与初治时的急性淋巴细胞白血病差异表达基因的cDNA文库,通过斑点杂交及基因测序,筛选出差异表达的未知基因的EST片段。选择其中一个EST片段,采用电子克隆结合RT-PCR方法获得未知基因的cDNA全长。半定量RT-PCR检测该基因在正常人和急性白血病病人中的表达。2.用长引物制备驱动组（driver）DNA模板,短引物制备实验组（tester）模板,验证阻断PCR对tester模板的选择性扩增作用。通过制备长度不同的同源DNA模板,验证聚合酶链转化反应将短模板转化成长模板的作用。以敏感和耐阿霉素的k562细胞为模型,检测聚合酶链转化-阻断PCR消减后,二者之间共有基因（β-actin）和差异表达基因（mdr-1）表达的变化,验证该方法对tester模板中差异表达基因的选择性扩增作用。结果1.成功构建消减效率高的一对来自同一个体复发与初治时的急性淋巴细胞白血病差异表达基因的cDNA文库。2.成功测序34份阳性克隆,其中20个片段为未知序列EST,其中13个EST片段经斑点杂交证实为差异表达基因。提示这些片段可能来自13个新基因,这些新基因可能与复发及耐药相关。已在美国NIH的基因库GenBank登录注册7个EST片段。注册号分别为:CB412259—CB412265。3.挑取其中一个EST（ssh369-24）,应用电子克隆结合RT-PCR方法进行cDNA的克隆,得到两个新的真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E）剪接异构体全长cDNA,分别命名为真核细胞翻译起始因子4E剪接异构体1（splicing variant1 of eIF4E ）和真核细胞翻译起始因子4E剪接异构体2（splicing variant2 of eIF4E ）。开放阅读框（open reading frame,ORF）分析结果表明二者编码的蛋白产物与eIF4E蛋白有所不同。4.半定量RT-PCR方法检测eIF4E剪接异构体2在正常人和白血病病人中的表达情况,发现正常人与急淋病人之间的表达无显著性差异;急单病人（初治和复发）表达量低于正常人和急淋病人,差异具有显著性（P<0.05）。5.阻断PCR对短引物制备的tester模板具有选择性扩增作用;对于长度不同的同源DNA模板,聚合酶链反应能够实现短模板向长模板的有效转化。6.经过聚合酶链转化-阻断PCR消减后Tester和Driver共同表达的β-actin的表达量较对照组（未转化组）减少约10个循环,而差异表达基因mdr-1的表达量无明显变化。结论1.成功构建消减效率高的一对来自同一个体复发与初治时的急性淋巴细胞白血病差异表达基因的cDNA文库。2.获得两个新的eIF4E剪接异构体全长cDNA,二者编码的蛋白产物与eIF4E蛋白有所不同。3.急单病人（初治和复发）eIF4E剪接异构体2表达量低于正常人和急淋病人,差异具有显著性。4.建立了一种新的筛选差异表达基因的方法-聚合酶链转化-阻断PCR消减法,该方法具有操作简单、耗时少、可直接获得全长cDNA等优点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 应用抑制消减杂交技术（SSH）筛选、分离、克隆急性白血病复发相关基因
• 前言
• 第一部分 复发与初治急性淋巴细胞白血病差异表达基因cDNA 文库的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二部分 两个新的eIF4E 剪接异构体全长cDNA 的克隆及表达分析
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2. 聚合酶链转化一阻断PCR 消减法：一种新的筛选差异表达基因方法的建立和验证
• 前言
• 第一部分：阻断PCR
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 第二部分：聚合酶链转化反应
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 第三部分 聚合酶链转化一阻断PCR 消减法用于差异基因筛选方法的建立和验证
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 全文总结
• 参考文献（1）
• 综述：eIF4E 与恶性肿瘤关系的研究进展
• 参考文献（2）
• 致谢